王秋宇 李曉翔 朱軍義

卵巢癌好發(fā)于50～60歲的絕經(jīng)后女性，在婦科惡性腫瘤排名第三位，是臨床上較為常見的女性生殖器官惡性腫瘤疾病[1,2]。國際癌癥研究中心報道指出，全世界每年有70萬新增卵巢癌患者，其病死率為18.78/10萬，占惡性腫瘤死亡病例的18.09%，2013年全球卵巢癌標化發(fā)生率為37.68/10萬，標化病死率為10.18/10萬[3，4]。因此深入探討卵巢癌的發(fā)病機制對卵巢癌患者的早期診斷、治療以及提高患者的生存質(zhì)量具有重要的意義。miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡也有有著密切的聯(lián)系。MiR-449a可通過抑制蛋白激酶B信號通路進而抑制腫瘤內(nèi)皮細胞增殖和集落形成。MiR-449a對免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用[5，6]。研究證實MiR-449a基因突變時，表達降低時，腫瘤細胞無限制増殖、血管生成速度加快，且相關(guān)細胞因子如VEGF、P53等均表達增高。多形性腺瘤基因鋅指蛋白2(pleomorphic adenoma gene 2，PLAG2)是促癌蛋白，其突變率為3%～11%，當其突變時，腫瘤細胞無限制増殖、血管生成速度加快，PLAG2基因突變在癌癥的早期就會出現(xiàn)，且PLAG2基因狀態(tài)不受藥物治療的阻斷[7，8]。目前關(guān)于MiR-449a和PLAGL2表達與卵巢癌關(guān)系的研究較少，本研究擬檢測MiR-449a和PLAGL2在卵巢癌組織中的表達水平，探討其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1.一般資料：選取2011年1月～2015年2月在筆者醫(yī)院婦科行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實的卵巢癌患者136例，患者年齡為40～74歲，平均年齡57.5±17.8歲，病程為9個月～4年，其中絕經(jīng)婦女64例、未絕經(jīng)婦女72例、未分化癌4例、子宮內(nèi)膜樣癌6例、透明細胞癌6例、混合型腺癌20例、漿液性腺癌82 例、黏液性腺癌18例。所有患者符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)公布的2013版《Ovarian cancer, version 2.2013》中關(guān)于卵巢癌的診斷標準[9]。手術(shù)切除標本后行病理檢查以判定腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、有無淋巴血管間隙浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時取距卵巢癌組織5cm以上的正常卵巢組織為癌旁組。患者自愿提供正常卵巢組織及卵巢癌組織標本，用作分析MiR-449a、PLAGL2蛋白的表達。納入標準：既往無精神障礙史，無心理疾患或精神疾病史；本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批，所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。排除標準：肝臟、腎臟、心功能異常者，感染性疾病、甲狀腺疾病、入院前接受放射治療化學(xué)治療的其他惡性腫瘤、膽汁淤積、自身免疫性疾病。

2.主要儀器和試劑：超凈工作臺(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)、MiR-449a、PLAGL2 Elisa試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司、熱電MK3酶標儀、MiR-449a、PLAGL2一抗購自上海邦奕生物科技有限公司、免疫組化二抗試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

3.ELISA測定MiR-449a、PLAGL2蛋白水平：所有實驗操作均為無菌操作，實驗所有器具高壓滅菌，37℃烘干。將保存在-70℃冰箱中的正常卵巢組織、卵巢癌組織取出解凍。稱取0.5g正常卵巢組織、卵巢癌組織，加入少量液氮，在微波碾磨儀(5000r/s)中迅速將其碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入1ml Eppendorf管中，加入0.8ml PBS(pH值為7.4)，充分振蕩混勻，2000×g，4℃，離心20min。仔細收集上清液。獲取正常卵巢組織、卵巢癌組織勻漿后，采用Elisa法檢測正常卵巢組織、卵巢癌組織的MiR-449a、PLAGL2蛋白表達量。

4.MiR-449a、PLAGL2在正常卵巢組織、卵巢癌組織的表達水平的測定：免疫組化法測定MiR-449a、PLAGL2在正常卵巢組織、卵巢癌組織中的表達，制作常規(guī)5μm的正常卵巢組織、卵巢癌組織石蠟切片，3%的H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%的MiR-449a、PLAGL2抗體工作液(稀釋濃度1∶200)購自英國Abcam公司，4℃過夜，加入二抗(IgG)，室溫30min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，(50%、60%、80%、90%、95%、100%)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。隨機選取5個高倍視野(×400)計數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計數(shù)；>50% 為(+++)，26%～50%為(++)，6%～25% 為(+)，陽性細胞≤5%為(-)，(-)及(+)歸為不表達組或低表達組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達組即為陽性。

結(jié) 果

1.癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2蛋白水平表達：由表1可見，卵巢癌組MiR-449a蛋白表達水平低于癌旁組，PLAGL2蛋白表達水平高于癌旁組(t=113.821、88.774，P<0.01)。

表1 癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2蛋白水平的表達

2.癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2表達的相關(guān)性：由表2、圖1可見，卵巢癌組MiR-449a陽性率低于癌旁組、PLAGL2陽性率高于癌旁組(χ2=18.708、151.786，P<0.01)。

表2 不同臨床病理特征組中MiR-449a、PLAGL2表達的相關(guān)性分析[n(%)]

圖1 MiR-449a、PLAGL2在癌旁組、卵巢癌組的表達(免疫組化法，×400)

3.MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系：由表3可見，MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與年齡相關(guān)性不明顯(χ2=0.348、2.429，P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5cm、病理學(xué)分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，MiR-449a蛋白陽性表達率越低、PLAGL2蛋白陽性表達率越高(χ2=21.889、17.231、32.026、24.764、49.788、13.782、23.791、15.460、19.436、20.424、17.352、15.631、36.560、23.042，P<0.01)。

表3 MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

4.MiR-449a、PLAGL2蛋白表達水平與卵巢癌患者預(yù)后分析：由表4及圖2可見，MiR-449a陽性組3年生存率及生存期均明顯高于MiR-449a陰性組,PLAGL2陰性組3年生存率及生存期均明顯高于PLAGL2陽性組(χ2=41.666、37.816、Z=17.980、18.092，P<0.01)。

表4 MiR-449a、PLAGL2蛋白表達水平與卵巢癌患者預(yù)后分析

圖2 MiR-449a、PLAGL2陽、陰組生存曲線

討 論

MiR-449a在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演者重要的角色，MiR-449a在Hedgehog 信號通路扮演著核心調(diào)節(jié)作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結(jié)合時，Ptch 抑制跨膜蛋白受體 (Smo)的活化，Smo 被釋放，其下游細胞因子MiR-449a被活化，促進MiR-449a移位到細胞核內(nèi)，進而抑制下游原癌基因[12]。此外低表達MiR-449a蛋白的腫瘤細胞黏附內(nèi)皮細胞的能力強，而腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞緊密結(jié)，才能穿過細胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶[10,11]。體外試驗已證實，MiR-449a能抑制癌細胞增殖，并能強烈促進細胞凋亡，高度表達MiR-449a的乳腺癌細胞株增殖能力明顯低于野生株[12]。本研究中卵巢癌組MiR-449a水平低于癌旁組，卵巢癌組MiR-449a陽性率低于癌旁組，且腫瘤最大徑≥5cm、病理學(xué)分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，MiR-449a表達越低，也與上述討論符合，同時也說明MiR-449a具有抑制癌細胞分化與侵襲遷移能力的作用。本研究同時也發(fā)現(xiàn)，MiR-449a陽性組3年生存率及生存期均明顯高于MiR-449a 陰性組，MiR-449a高表達能明顯提高卵巢癌患者預(yù)后。

PLAGL2是原癌基因，其結(jié)構(gòu)、功能的異常與遺傳性及散發(fā)性腫瘤均相關(guān)。近年來國外人群流行病學(xué)研究顯示，在乳腺癌的發(fā)病過程中，MiR-449a的過度表達會明顯下調(diào)PLAG2的表達，進而對乳腺癌細胞的分化及遷移起到抑制作用[13]。此外，PLAGL2在調(diào)節(jié)人體細胞的復(fù)制、遺傳物質(zhì)DNA損傷修復(fù)、細胞的正常生長方面有重要作用。遺傳基因?qū)W發(fā)現(xiàn)PLAGL2過表達是引發(fā)大部分遺傳性腫瘤的主要原因。PLAGL2是Wnt信號通路的重要組成部分，其通過與膜結(jié)合鈣黏素結(jié)合形成復(fù)合體，定位與細胞骨架，維持組織細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[14～16]。研究表明，若Wnt信號通路異樣，則PLAGL2過表達，胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin進入胞核，激活下游癌基因(P53、Ras等)，促進癌細胞增殖。本研究中，卵巢癌組PLAGL2水平高于癌旁組，卵巢癌組PLAGL2陽性率高于于癌旁組，這與上述結(jié)論一致。研究還發(fā)現(xiàn)，IL-8、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)由可能由PLAGL2調(diào)控，高表達PLAGL2蛋白的腫瘤細胞可分泌更多的IL-8、血管及VEGF，而VEGF、IL-8在供應(yīng)腫瘤生長的血管系統(tǒng)的形成及實體腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17]。

本研究中，腫瘤最大徑≥5cm、病理學(xué)分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，PLAGL2表達越高，也證實了這一點。此外，PLAGL2基因突變一般發(fā)生于腫瘤的早期。PLAGL2基因突變后，處于高度活化狀態(tài)，且不受EGFR信號通路的調(diào)控，即使用EGFR拮抗劑阻斷了上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，突變的PLAGL2的仍可發(fā)揮其促腫瘤增殖作用， EGFR拮抗劑對PLAGL2基因突變的惡性腫瘤患者不能發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。本研究中PLAGL陰性組3年生存率及生存期均明顯高于PLAGL 陽性組，推測PLAGL具有促進癌細胞分化與侵襲遷移能力的作用，PLAGL高表達能明顯降低卵巢癌患者預(yù)后，與上述討論一致。近期研究表明，PLAGL2蛋白對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，其具有時間、空間表達特異性，若藥物抑制PLAGL2蛋白表達，腫瘤細胞的生長得到有效抑制，PLAGL2可能成為腫瘤治療的分子靶點，這有待于進一步研究證實[19]。

綜上所述，MiR-449a在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起抑制作用，PLAGL2起促進作用；MiR-449a蛋白在卵巢癌組織中表達量降低，PLAGL2蛋白表達量增加；MiR-449a蛋白高表達的卵巢癌患者能獲得較好的預(yù)后，PLAGL2蛋白低表達能獲得較好的預(yù)后。