肖業(yè)達 黃亞醫(yī) 黃 婷 汪華新 趙 博 王雅楓

腎缺血再灌注損傷是臨床上最為常見的病理生理現(xiàn)象，其可發(fā)生于嚴重的創(chuàng)傷、休克和感染等情況[1]。而大宗臨床研究表明：糖尿病患者腎缺血再灌注損傷發(fā)生率更高，預(yù)后更差[2]。因此糖尿病腎缺血再灌注損傷的發(fā)生機制及其防治策略成為亟待解決的臨床熱點之一。

寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nod-like receptor, NLRs)是在宿主先天性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的細胞內(nèi)特異性蛋白，可以識別胞質(zhì)內(nèi)的病原相關(guān)分子。炎性復(fù)合體概念最早由Tschopp于2002年提出，炎性復(fù)合體結(jié)構(gòu)包括凋亡相關(guān)斑點樣蛋白，半胱天冬酶1前體(pro-caspase-1)和一種NLRs。其中NLRP3是目前結(jié)構(gòu)功能研究最多的炎性體。當NLRP3被激活后，可以使pro-caspase 1裂解為有活性的cleaved-caspase-1，從而進一步促進炎性因子前體成熟，轉(zhuǎn)化為有活性的IL-1β和IL-18[3]。研究表明NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用[4,5]。同時相關(guān)研究表明NLRP3參與了糖尿病腎病的發(fā)生和進展[6，7]。而該信號通路在糖尿病腎臟缺血再灌注損傷的研究中尚未見報道。因此，本研究通過建立HK-2細胞高糖缺氧復(fù)氧模型，觀察NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路在HK-2細胞損傷中的變化。

材料與方法

1.材料：人腎小管上皮細胞HK-2購自美國ATCC公司，DMEM低糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，caspase-1活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，活性氧(ROS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，NLRP3抗體購自美國Nous公司，NLRP3抑制劑BAY11-7085購自中國上海藍木化工有限公司。

2.細胞培養(yǎng)及分組：HK-2細胞用含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度5.5mmol/L)，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。當細胞生長到70%～80%，用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細胞，吹打并傳代。采用數(shù)字表法將HK-2細胞隨機分為低糖組(NG組)、低糖缺氧復(fù)氧組(NHR組)、高糖組(HG組)、高糖缺氧復(fù)氧組(HHR組)和高糖缺氧復(fù)氧+NLRP3抑制劑BAY11-7085組(HHR-BAY)。高糖模型的建立：HK-2細胞鋪板用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24h后加入高糖(葡萄糖終濃度30mmol/L)培養(yǎng)72h。高糖缺氧復(fù)氧模型的建立：HHR組高糖(30mmol/L)培養(yǎng)72h后進行缺氧4h，復(fù)氧2h處理。HHR-BAY組予以NLRP3抑制劑BAY11-7085 5μmol/L與高糖同時作用72h后缺氧復(fù)氧[8]。

3.指標檢測：(1)根據(jù)試劑說明書，酶標儀測定細胞CCK-8、SOD。(2)ELISA法檢測IL-1β和caspase-1。(3)免疫熒光檢測NLRP3：PBS浸洗爬好細胞的玻片3min×3次；4%多聚甲醛固定；0.5%Triton X-100室溫通透20min；血清室溫封閉30min；滴加一抗(NLRP3：1∶50)，4℃孵育過夜；加熒光二抗(1∶100)，濕盒中室溫孵育1h；滴加DAPI避光孵育5min，進行染核；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。(4)免疫印跡法檢測NLRP3：冰上裂解細胞，蛋白定量，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入NLRP3一抗(1∶200)過夜，TBST洗滌3次，10分鐘/次，加入二抗，室溫孵育2h，TBST洗滌3次，10分鐘/次，發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，掃描灰度值，分析結(jié)果。(5)采用DCHF-DA活性氧檢測試劑盒測定細胞內(nèi)ROS水平。將HK-2細胞接種于6孔板，當細胞生長貼壁80%時更換無血清培養(yǎng)基同步化后按實驗分組處理后，根據(jù)說明書進行操作，用酶標儀檢測485/525nm下的熒光強度。測定結(jié)果以熒光強度/毫克蛋白表示。

結(jié) 果

1.SOD活性：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組細胞存活率顯著降低，ROS含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組ROS含量明顯升高，細胞存活率，SOD活性明顯降低(P<0.05)；并且與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組ROS含量進一步明顯升高，細胞存活率，SOD活性進一步明顯降低(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組ROS含量明顯降低，細胞存活率，SOD活性明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 5組細胞細胞存活率、SOD活性、ROS水平的比較

2.caspase-1活性：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組caspase-1活性，IL-1β含量均升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組caspase-1活性，IL-1β含量均升高(P<0.05)；與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組IL-1β含量，caspase-1活性升高更為顯著(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組caspase-1，IL-1β均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 5組細胞caspase-1活性，IL-1β水平的比較

3.Western blot法檢測：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達均升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達含量均升高(P<0.05)；與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達升高更為顯著(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組NLRP3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 各組細胞NLRP3蛋白表達水平

免疫熒光檢測結(jié)果顯示高糖刺激與缺氧復(fù)氧均可以誘導(dǎo)NLRP3蛋白表達，與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3表達升高，而NLRP3抑制劑BAY11-7082可在高糖缺氧復(fù)氧條件下抑制NLRP3表達，詳見圖2。

圖2 各組細胞NLRP3蛋白免疫熒光結(jié)果(×200)

討 論

缺血導(dǎo)致的低灌注和膿毒血癥是人類急性腎損傷的最常見原因[9]。腎臟接受心排出血液量的25%，因此無論是體循環(huán)還是腎循環(huán)的衰竭都將會對腎灌注造成嚴重影響，導(dǎo)致缺血再灌注損傷[10]。腎缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腎臟細胞廣泛或局部的氧供失衡及代謝物排出障礙，這種代謝失衡會導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷[11]。

糖尿病可以增加機體氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致活性氧自由基水平增高，而活性氧的增多又可進一步導(dǎo)致機體更為嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[12]。研究表明，高糖會導(dǎo)致腎間質(zhì)細胞和上皮細胞的活性氧自由基水平上升，使機體處于高氧化應(yīng)激和強炎性反應(yīng)狀態(tài)[13,14]。而慢性氧化應(yīng)激可以消除麻醉預(yù)處理和缺血預(yù)處理對缺血再灌注損傷的保護作用[15,16]。故氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的細胞信號通路激活對糖尿病腎缺血再灌注損傷的作用機制是臨床研究的熱點。

大量報道表明糖尿病患者腎臟缺血再灌注損傷明顯加重[17]。高血糖可以加重細胞氧化應(yīng)激損傷，細胞在高糖環(huán)境下缺氧復(fù)氧損傷的易感性增加[8,18]。本研究采取高糖刺激HK-2細胞72h，缺氧4h復(fù)氧2h模擬糖尿病缺血性腎損傷[19]。結(jié)果顯示，高糖刺激72h后，HK-2細胞CCK-8結(jié)果顯示細胞活性顯著下降。再進行缺氧(4h)復(fù)氧(2h)處理，CCK-8結(jié)果顯示高糖缺氧復(fù)氧致細胞損傷較低糖缺氧復(fù)氧明顯進一步加重，顯示了細胞對高糖狀態(tài)下缺氧復(fù)氧損傷的易感性。同時高糖刺激下細胞氧化應(yīng)激水平顯著上升，表現(xiàn)為ROS大量生成，SOD活性下降。同時在缺氧復(fù)氧處理后，高糖組較低糖組氧化應(yīng)激水平進一步顯著上升。證實了高糖合并缺氧復(fù)氧會進一步破壞細胞氧化/還原平衡，刺激細胞氧化應(yīng)激水平上升，導(dǎo)致更為嚴重的損傷。筆者由此推測：細胞氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致高糖缺氧復(fù)氧致細胞損傷加重的重要作用機制之一。

NLRP3的激活參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括代謝綜合征和腎臟疾病[20,21]。大量研究表明鉀離子外流，溶酶體破裂和ROS均可以激活NLRP3，其中細胞內(nèi)ROS的生成是激活NLRP3的關(guān)鍵因素[22]。NLRP-3激活致caspase-1/IL-1β活化，而IL-1β在腎缺血再灌注病理進程中發(fā)揮了重要作用[23]。本研究免疫熒光和Western blot法檢測蛋白結(jié)果顯示，NLRP3/caspase-1/IL-1β信號軸在高糖或低糖缺氧復(fù)氧條件下顯著上調(diào)，并且在高糖缺氧復(fù)氧條件下進一步顯著上調(diào)。說明NLRP3在糖尿病缺血性急性腎損傷機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

為進一步探討NLRP3/caspase-1/IL-1β信號通路是否參與高糖缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)HK-2細胞損傷的過程，本研究觀察了NLRP3抑制劑BAY11-7082對高糖缺氧復(fù)氧對細胞損傷作用的影響。BAY11-7082可抑制NLRP3激活，進而阻斷其下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制其相應(yīng)的生理病理效應(yīng)[8,24]。研究結(jié)果顯示BAY11-7082可有效抑制高糖缺氧復(fù)氧損傷HK-2細胞的過程，顯著提高細胞存活率，減少NLRP3蛋白的表達及caspase-1活性和IL-1β含量，抑制氧化應(yīng)激水平。為深入闡明抑制NLRP-3/caspase-1/IL-1β信號通路的激活可能是降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵之一提供了實驗證據(jù)。

綜上所述，高糖缺氧復(fù)氧致HK-2細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，NLRP-3/caspase-1/IL-1β信號通路上調(diào)，可能是高糖缺氧復(fù)氧導(dǎo)致細胞損傷惡化的重要機制,為將來預(yù)防治療圍術(shù)期糖尿病腎缺血再灌注損傷提供新的靶點。