孫琪，王琪，劉琨毅，*，趙金松，夏熙洋

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003；2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；3.宜賓市三中，四川宜賓644000）

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾?；蚪湍妇c乳酸菌的混合菌為發(fā)酵劑，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆?jié){與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來研究的熱點[9-11]。豆?jié){酒作為一種含有酒精的復(fù)合飲料，與傳統(tǒng)的乳酒相比，其特點是含有豐富的植物蛋白和豆乳的其他營養(yǎng)成分，既補充了我國居民因牛乳等動物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統(tǒng)的乳酒口感更加柔和[12-14]。雖然豆?jié){酒酒體風(fēng)味獨特、口感柔和，但是其中的豆腥味始終不能很好地去除進而影響豆?jié){酒整體的感官特性[14-15]。

復(fù)合型發(fā)酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發(fā)酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點與優(yōu)勢，彌補利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營養(yǎng)成分不足等缺陷[16]。洋蔥是藥食兩用的蔬菜，具有去腥增香的作用且富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如含硫化合物、維生素、類黃酮、花色苷、甾體化合物、前列腺素A 等，因而使其具有抑菌抗氧化、降低心血管發(fā)病率、緩解糖尿病癥等保健功能[17-21]。因此，本試驗通過洋蔥汁與豆?jié){混合發(fā)酵釀造，以期釀出的酒體風(fēng)味突出、口感幼滑、酸度適中且具有一定功效的豆?jié){酒，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；大豆、洋蔥、白砂糖：宜賓大潤發(fā)超市；冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉：均為分析純，湖北鑫潤德化工有限公司；亞硫酸鈉（分析純）：南京試劑有限公司；硫酸銅（分析純）、酒石酸鉀鈉（分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；次甲基藍(lán)：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C91T 型豆?jié){機：九陽股份有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA20043型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機：鄭州長城工貿(mào)有限公司；MCGNP-9080 系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱：青島明成環(huán)?？萍加邢薰?；DSX-280A 型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BCD-2HBSA 型電冰箱：青島海爾股分有限公司；PHs-3c 型精密pH 計：上海理達(dá)儀器廠；Alcomat Super 酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司。

1.3 洋蔥豆?jié){酒釀造工藝流程

操作要點：挑選顆粒成熟飽滿的大豆，去除其中的雜質(zhì)，清水洗凈后用5 倍質(zhì)量的清水浸泡9 h～12 h；將浸泡好的大豆按1∶10 的質(zhì)量比加水磨漿后根據(jù)單因素試驗及響應(yīng)面試驗的條件添加洋蔥汁及不同濃度的白砂糖，用檸檬酸溶液調(diào)pH值到5.0 后添加0.02%的亞硫酸鈉，以抑制雜菌的生長；在無菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液，25 ℃發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 理化指標(biāo)測定方法

總糖（以葡萄糖計）測定：斐林試劑法[22]；酒精體積分?jǐn)?shù)測定：密度瓶法[22]；總酸測定：電位滴定法[22]；氨基酸態(tài)氮測定：甲醛滴定法[22]。

1.4.2 感官評價

感官評價在學(xué)院食品品評室內(nèi)完成，邀請13 位教師及實驗員組成評定小組，明確感官評定的指標(biāo)和注意事項。參照符楨華、周傳云等人對豆?jié){酒的研究方法[13-14]及標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23546-2009《奶酒》[22]對洋蔥豆?jié){酒從色澤（滿分5 分）、組織形態(tài)（滿分5 分）、香氣（滿分30 分）、滋味（滿分40 分）、典型性（滿分20 分）5 個方面制定洋蔥豆?jié){酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

表1 洋蔥豆?jié){酒評分細(xì)則Table 1 Scoring rubric of onion soymilk liquor

1.4.3 洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

1.4.3.1 白砂糖添加量對洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵效果的影響

在豆?jié){中加入4%的洋蔥汁后煮沸，分別加入8%、10 %、12 %、14 %、16 %的白砂糖及0.02 %的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，25 ℃發(fā)酵5 d 后分別記錄洋蔥豆?jié){酒的感官特征，以確定較佳的白砂糖添加量。

1.4.3.2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的百分比添加到豆?jié){中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，25 ℃發(fā)酵5 d 后進行感官評價，以確定較佳的洋蔥汁添加量。

1.4.3.3 接種量對洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照4%的添加量加入到豆?jié){中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后分別接入0.10 %、0.15 %、0.20 %、0.25 %、0.30 %的酵母菌，25 ℃發(fā)酵5 d 后分別進行感官評價，以確定較佳的酵母菌接種量。

1.4.3.4 發(fā)酵時間對洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵效果的影響

將洋蔥汁分別按照4 %的添加量加入到豆?jié){中煮沸，并添加12%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.2%的酵母菌，在25 ℃的條件下分別發(fā)酵3、4、5、6、7 d 并進行感官評價，以確定較佳的發(fā)酵時間。

1.4.4 洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken[23]的中心組合試驗設(shè)計原理，進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，確定洋蔥豆?jié){酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.5 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個試驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。采用OriginPro 9.1 軟件進行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計分析。Design Expert 8.0.6 軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 白砂糖添加量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響

控制處理條件為洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%、發(fā)酵時間5 d，考察在白砂糖添加量分別為8%、10%、12%、14%、16%時洋蔥豆?jié){酒的感官評分，結(jié)果見圖1。

圖1 白砂糖添加量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖1可知，當(dāng)洋蔥豆?jié){酒中白砂糖添加量從8 %增加到12%，洋蔥豆?jié){酒的感官評分也隨之增加；當(dāng)添加量達(dá)到12%時，洋蔥豆?jié){酒的感官評分達(dá)到最高分（74.82±0.83）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，洋蔥豆?jié){酒的感官評分開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。糖分在洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵過程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[14]，洋蔥豆?jié){酒在發(fā)酵過程中，可發(fā)酵性糖偏少會出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，可發(fā)酵性糖過多則會造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為10%、12%及14%用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗。

2.1.2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響

洋蔥汁添加量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響見圖2。

圖2 洋蔥汁添加量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響Fig.2 Effect of onion juice addition on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖2可知，洋蔥汁能顯著改善豆?jié){酒的風(fēng)味特征，不僅能有效去除豆?jié){酒中的豆腥味，而且能賦予豆?jié){酒獨特的風(fēng)味。洋蔥豆?jié){酒的感官評分隨著洋蔥汁添加量的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，當(dāng)洋蔥汁添加量為4%時，洋蔥豆?jié){酒的感官評分達(dá)到最高的（74.82±0.83）分。因洋蔥汁含有大量的合丙烷硫醛和硫氧化物等物質(zhì)，故使其具有較強的辛辣味[17]，洋蔥汁加入量過大會導(dǎo)致洋蔥豆?jié){酒呈現(xiàn)出較強的刺激性及辛辣感，因此當(dāng)洋蔥汁添加量適當(dāng)時才能賦予洋蔥豆?jié){酒特殊的風(fēng)味。由此選擇3%、4%、5%的洋蔥汁添加量用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.3 接種量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響

接種量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響見圖3。

圖3 接種量對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculums concentration on sensory evaluation of onion soymilk liquor

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的不斷增加，洋蔥豆?jié){酒的感官評分也隨之不斷增加。當(dāng)酵母菌接種量為0.30%時，洋蔥豆?jié){酒的感官評分達(dá)到最高的（76.24±1.01）分。酵母菌在發(fā)酵過程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時還會產(chǎn)生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[13]。當(dāng)酵母菌接種量偏低時，容易使釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成洋蔥豆?jié){發(fā)酵酒度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)酵母菌的接種量為0.25%時，其洋蔥豆?jié){酒的感官評分雖然較酵母菌接種量為0.30%時低，但兩者并無顯著性差異（p＞0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.20%～0.30%用于響應(yīng)面法試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響

控制處理條件白砂糖添加量12%、洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%，分別考察發(fā)酵時間為3、4、5、6、7 d時洋蔥豆?jié){酒的感官評分，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)洋蔥豆?jié){酒的發(fā)酵時間為4 d 時，洋蔥豆?jié){酒的感官評分最高為（78.50±0.72）分。當(dāng)發(fā)酵時間短于4 d 時，可發(fā)酵性糖類還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，香味不濃郁。當(dāng)發(fā)酵時間長于4 d時，酒體產(chǎn)生了不良?xì)馕?，破壞了酒汁的風(fēng)味，其原因可能是洋蔥汁在長時間發(fā)酵過程中，其中的含硫化合物被分解代謝后產(chǎn)生了一些不愉悅的氣味[18]。表明在白砂糖添加量12%、洋蔥汁添加量4%、接種量0.20%的條件下，洋蔥豆?jié){酒的最佳發(fā)酵時間在4 d 左右。因此選擇發(fā)酵時間為3 d～5 d 用于后續(xù)試驗。

圖4 發(fā)酵時間對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of onion soymilk liquor

2.2 響應(yīng)面法試驗

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗設(shè)計原理，通過Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計響應(yīng)面法試驗，對白砂糖添加量、洋蔥汁添加量、接種量、發(fā)酵時間4 個因素分析得到以下試驗方案及結(jié)果，見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 3 Experimental design and results for response surface analysis

再通過Design-Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面法試驗得到的感官評分（表3）進行方差分析，得到結(jié)果如表4所示。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

由表4可知，4 個因素對洋蔥豆?jié){酒感官評分影響的強弱順序依次為：發(fā)酵時間＞白砂糖添加量＞洋蔥汁添加量＞接種量，其中發(fā)酵時間對洋蔥豆?jié){酒感官評分的影響顯著（p＜0.05）。白砂糖添加量與發(fā)酵時間之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）。設(shè)白砂糖添加量、洋蔥汁添加量、接種量、發(fā)酵時間分別為A、B、C、D，以洋蔥豆?jié){酒的感官評分為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，得到洋蔥豆?jié){酒感官評分回歸方程：洋蔥豆?jié){酒感官評分=85.70+0.92A-0.90B+0.12C-1.58D+0.89AB+0.89AC-2.42AD-0.58BC-0.56BD-1.05CD-2.82A2-0.98B2-1.84C2-2.84D2

根據(jù)表4 中方差分析結(jié)果，洋蔥豆?jié){酒感官評分的回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系模型顯著（p＜0.05），且失擬項檢驗不顯著（p＞0.05），表明未知因素對試驗結(jié)果的干擾較小，該試驗?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)，洋蔥豆?jié){酒感官評分的回歸方程是洋蔥豆?jié){酒感官評分與洋蔥豆?jié){酒發(fā)酵工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，即可以利用此回歸方程確定洋蔥豆?jié){酒釀造的最佳工藝[24]。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[25]。根據(jù)洋蔥豆?jié){酒感官評分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果見圖5。

圖5 兩因素交互作用對感官評分的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effect of operating parameters on the sensory evaluation

由響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大的原則[24-26]可知，因子A（白砂糖添加量）與因子D（發(fā)酵時間）之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭，即因子A與因子D相互之間具有最強的交互作用。該結(jié)果與表4 方差分析所得的白砂糖添加量與發(fā)酵時間之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）的結(jié)論相吻合。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析確定洋蔥豆?jié){酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量12.94%、洋蔥汁添加量3.81%、接種量0.27%及發(fā)酵時間3.49 d，此條件下由公式算出的理論值為86.32 分。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進行3 組驗證試驗，驗證試驗的條件為白砂糖添加量12.9%、洋蔥汁添加量3.8%、接種量0.27%及發(fā)酵時間3.5 d，得到洋蔥豆?jié){酒的感官評分為（86.78±1.04）分，測定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 理化指標(biāo)分析

經(jīng)測得洋蔥豆?jié){酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的總糖為13.1 g/L、酒精度4.5 %vol、總酸7.6 g/L、氨基酸態(tài)氮0.12 g/L。4種理化指標(biāo)均符合中華人民共和國GB/T 23546-2009《奶酒》標(biāo)準(zhǔn)[22]。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對洋蔥豆?jié){酒的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，影響洋蔥豆?jié){酒感官評分的工藝因素按主次順序排列為發(fā)酵時間＞白砂糖添加量＞洋蔥汁添加量＞接種量。最終確定了其最優(yōu)工藝條件為：將浸泡好的大豆按1∶10 的質(zhì)量比加水磨漿后添加3.8%的洋蔥汁，并加入12.9%的白砂糖，用檸檬酸溶液調(diào)pH值到5.0 后添加0.02%的亞硫酸鈉，在無菌環(huán)境條件下接入0.27%經(jīng)活化后的酵母菌懸液，在25 ℃條件下發(fā)酵3.5 d 后置于4 ℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃、透明，豆香、蔥香與酒香和諧、酒體圓潤的洋蔥豆?jié){酒，其感官評分為86.78 分。