程茵，馬光耀，趙瑩，盛玉輝，李雪青，周揚，宋希強，王健

（海南大學熱帶農林學院/環(huán)南海陸域生物多樣性研究中心，海南?？?70228）

睡蓮（Nymphaea tetragona），又稱為水芹花、子午蓮、瑞蓮、水浮花、水洋花或小蓮花等，是睡蓮目（Nymphaeales） 睡 蓮 科（Nymphaeaceae） 睡 蓮 屬（Nymphaea）植物[1]，屬多年生水生草本花卉[2]，廣泛分布于溫帶、亞熱帶及熱帶地區(qū)。根據生態(tài)學特征，睡蓮可以分為熱帶睡蓮和耐寒睡蓮[3]。睡蓮是一種著名的水生花卉，擁有美麗的花朵、優(yōu)美的姿態(tài)、迷人的芳香，招人喜愛，具有很高的觀賞價值，是園林水景配置中不可缺少的素材[4]。

由于睡蓮具有白天開花夜晚關閉的特性，被人們稱之為“花中的睡美人”。近年來國內外對睡蓮屬植物的研究主要集中在植物的資源分布和分類、化學成分及成分的藥理作用和應用、生物活性、對水體的凈化效應以及切花保鮮幾個方面。研究表明我國原產種有5 個，經育種專家長期的選育，現已有品種上千個。研究發(fā)現，睡蓮屬植株主要成分包括黃酮類、酚酸類、生物堿類、木脂素和多糖類等多種物質，具備抗氧化、抗菌、抗炎、抗輻射、降血糖、降血壓等多種生物活性[5]。研究還發(fā)現睡蓮的根能汲取水中的重金屬有毒物質如鉛、汞等，可以使污染的水體得到有效的凈化[6]。此外，睡蓮植物還可以作為鮮切花和工藝干花材料，研究表明適當濃度的赤霉素處理利于睡蓮的保鮮，能增大花莖和使莖干挺直，從而延長其開花壽命，具有較高的經濟價值[2]。

睡蓮的花露是睡蓮花朵自然分泌出來的液體物質，可以聚集在睡蓮雌蕊上，是睡蓮吸引昆蟲授粉的主要營養(yǎng)物質，具有甜蜜的味道和芳香的氣味，是一種天然的植物精華。一朵睡蓮可以產生多達20 mL 的花露，具有作為高端營養(yǎng)飲品開發(fā)的潛力。但是睡蓮花露的主要活性成分目前還不清楚，也不了解其活性功能，特別是其抗氧化能力的強弱，這限制了它的開發(fā)和利用。

目前對于睡蓮植物提取物抗氧化活性的研究也取得了一些成果[7]。已有研究證明藍睡蓮植株中含有槲皮素等多種多酚物質，能延長食品的貨架期，具有抗氧化、抗衰老、降血脂及降糖等多種生物活性，可作為抗氧化劑和抗糖尿病的物質成分，在功能性食品、病理方面及化妝品等行業(yè)有一定的應用價值[8]。為進一步了解睡蓮花露的主要活性成分，并弄清其抗氧化能力強弱，本研究采用液相色譜-質譜法（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）分析其主要的活性成分，并采用3 種方法測定其抗氧化能力，以期為睡蓮花露的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

睡蓮花露：采自海南榮豐花卉有限公司的‘藍鳥’睡蓮（Nymphaea‘Blue Bird’）。2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tripyridyl-s-trizine，TPTZ）、1，1-二苯基-2-三硝 基 苯 肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2'-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）：Sigma 公司；硫化亞鐵（六水）、鹽酸、甲醇、乙醇、抗壞血酸鈉等均為國產分析純：上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

Lambda 25 紫外可見分光光度計：美國PerkinElmer公司；HHS 型恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)醫(yī)療設備廠；PHS-3E 酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；AB 5600+Triple TOF 質譜儀：美國AB SCIEX 公司。

2 方法

2.1 睡蓮花露的采集及前期處理

于晴朗天氣早上8：00～10：00，用膠頭滴管從睡蓮子房中吸取自然分泌產生的花露，在超凈工作臺上利用高壓滅菌過的濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，得到純凈花露，儲存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 睡蓮花露主要代謝成分的測定

吸取200 μL 花露樣品到EP 管中，加入800 μL 甲醇/乙腈（1 ∶1，體積比）溶液，渦旋混合30 s，4 ℃水浴超聲破碎10 min，放入液氮1 min，室溫（25 ℃）復溫，4 ℃水浴超聲破碎10 min（重復3 次），-20 ℃靜置1 h，將樣本4 ℃、13 000 r/min 離心15 min；取上清于EP 管中，真空抽干，加入150 μL 50%甲醇水溶液渦旋30 s 溶解，4 ℃水浴超聲10 min，13 000 r/min 離心15 min，去上清進行上機檢測。色譜檢測采用梯度混合，流動相條件為：A：水∶乙腈∶甲酸（900 ∶100 ∶1）；B：乙腈∶水∶甲酸（900 ∶100 ∶1）；柱溫35 ℃，上樣量10 μL。采用AB5600+Triple TOF 質譜儀，在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA 功能進行一級、二級質譜數據采集，一級掃范圍m/z（50～1 000），二級掃范圍m/z（25～1 000），一級轟擊能量：10 eV，二級轟擊能量：30 eV。ESI 離子源參數設置如下：霧化氣壓（GS1）：55Pa，輔助氣壓：55 Pa，氣簾氣壓：40 Pa，溫度：550 ℃（正離子模式）；450 ℃（負離子模式），噴霧電壓：±5 500 V（正負離子模式）。得到的數據首先使用Analysis Base File Converter 轉換為.abf 格式，再通過MSDIAL 軟件，在對轉換成的abf 文件里對代謝物離子峰進行峰尋找、峰提取、鑒定等數據處理，同時基于一級與二級圖譜搜 索MassBank、MassBank of North America（MoNA）、Respect、Global NaturalProducts Social Molecular Networking（GNPS）數據庫，得到鑒定結果，最終得出花露主要的成分。

2.3 睡蓮花露抗氧化能力的測定

2.3.1 DPPH 法測定

DPPH 測試液的配制方法參照賓宇波等[9]的方法：稱取DPPH 0.017 g，加入100 mL 的甲醇進行充分溶解。取2 mL DPPH 溶液加入到小試管中，加1 mL 甲醇試劑，混合之后，在517 nm 處測A值（空白對照組），記為A0。另外取2 mL DPPH 測試液，分別加入250、300、350、400 μL 睡蓮花露，加入甲醇補齊到3 mL，在517 nm處的吸光值A，每個處理進行3 次重復試驗。根據以下公式求得睡蓮花露對DPPH 自由基的清除率[10-12]。

清除率/%=（A0-A）/A0×100

式中：A0為未加樣品的DPPH 測試液的吸光值；A為加入樣品后測得的吸光值。

2.3.2 FRAP 法測定

FRAP 工作液的配制參照郭長江等[13]的方法：①稱取4.08g 乙酸鈉（三水），加16 mL 冰醋酸，定容至100 mL（調整pH=3.6）。②稱取TPTZ 粉末31.2 mg，溶于10 mL 40 mmol/L HCl 溶液中，溶液澄清透明。③稱取1.35 g FeCl·36H2O，用25 mL 水溶解，取1 mL 溶液加入9 mL的去離子水，得到10 mL 溶液。將以上①②③步配好的100、10、10 mL 3 種溶液混合，得到FRAP 工作液。稱取695 mg FeSO·46H2O，用去離子水定容到25 mL，此濃度為100 mmol/L，然后分別稀釋成1、2、3、4、5、10 mmol/L的濃度溶液，取2 mL 的FRAP 工作液與3 mL 的不同濃度的FeSO4溶液進行反應，測定反應后溶液的吸光度A值，用3 mL 乙醇和2 mL FRAP 工作液的混合溶液作為空白組進行調零，繪制FRAP 標準曲線。最后測定3 mL 睡蓮花露與2 mL FRAP 工作液反應后溶液的吸光度，代入標準曲線的回歸方程，得到睡蓮花露的抗氧化能力（以達到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數表示）[14-15]，并且進行3 次重復試驗。

(2)若CP(a)＞1,則P?(G)的連通分支個數為k(P?(G))=s1(P)-s1(Φ(P))+1.

2.3.3 TRAP 法測定

AAPH 與ABTS 的醋酸鹽緩沖液的配制參照田玉紅等[16]：稱取少量醋酸鈉，加入醋酸調節(jié)pH值約4.3，用此醋酸鹽緩沖液將0.02 g ABTS 和0.27 g AAPH 分別溶解，再一起定容到500 mL。然后取5、10、15、20、25、30、35 μL 的睡蓮花露，分別加入到5 mL 的配制的混合液中，然后在734 nm 下測吸光度值，以5mL 的1 mmol/L 抗壞血酸鈉溶液作為標準參照，根據以下公式求得TRAP 值后，繪制花露加入量與TRAP 值的線性相關曲線[16-17]。

TRAP 值（mmol/L）=（A樣-A0）（/A標準-A0）×C標準

式中：A樣是睡蓮花露測得的吸光值；A0是空白對照液的吸光值（此處A0=0），C標準是標準參照的濃度（此處C標準=1），A標準是標準參照（抗壞血酸鈉）的吸光值，TRAP 值是指相當于多少mmol/L 的抗壞血酸鈉。

3 結果與分析

3.1 睡蓮花露主要成分

對代謝物離子峰進行峰尋找、峰提取及鑒定，得出睡蓮花露的正離子峰數有167，負離子峰數有205，結果如表1所示。

表1 代謝物質保留峰數目Table 1 The number of retention peaks of metabolic substances

由睡蓮花露成分分析得到的正負離子流圖見圖1、圖2。

由質譜分析得到睡蓮花露的主要成分里面含有D-葡萄糖酸、3，9，10-三羥基-4-（甲氧基甲基）-1，7-二甲基-6-氧代苯并[b][1，4]苯并二氧雜環(huán)庚二烯-2-羧酸、馬來酸甲麥角新堿、硫代異鼠李糖甘油二酯、單半乳糖甘油二酯、威嚴仙皂苷C、槲皮素、葡萄糖醛酸、肌醇半乳糖苷、3-（8-二氧基）苯酚等多種化合物質。包括多糖類、酸類、萜類、酯類、黃酮類以及氨基酸和維生素類物質，結果如表2所示。

3.2 DPPH 法測定試驗結果

圖1 睡蓮花露成份正離子模式總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of positive ion mode of waterlily stigmatic exudate

圖2 睡蓮花露成份負離子模式總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of negative ion mode of waterlily stigmatic exudate

表2 睡蓮花露的主要代謝成分Table 2 The main metabolites of waterlily stigmatic exudate

續(xù)表2 睡蓮花露的主要代謝成分Continue table The main metabolites of waterlily stigmatic exudate

圖3 不同花露體積加入量對清除率的影響Fig.3 The free radical scavenging activity of different volumes of waterlily stigmatic exudate

3.3 FRAP 法測定試驗結果

FeSO4標準曲線見圖4。

由圖4可知，FeSO4濃度與A吸光度呈正向線性相關，回歸方程為y=0.002x-0.001 1，R2=0.978 2。加入樣品反應測得的A的平均值=0.011 6，根據標準曲線可以求得y=6.35，即花露抗氧化能力相當于6.35 mmol/L的FeSO4。

圖4 FeSO4 標準曲線Fig.4 The standard curve of FeSO4

3.4 TRAP 法測定試驗結果

通過TRAP 法測定睡蓮花露的氧化能力，見圖5。

由圖5可知，睡蓮花露樣的TRAP 值與花露加入的體積呈正向線性相關，y=0.039 9x+1.2219，R2達到0.993 9?；恫煌w積的加入量其抗氧化能力可以用抗壞血酸鈉的濃度表示，其中5 μL 睡蓮花露其抗氧化能力相當于1.425 2 mmol/L 的抗壞血酸鹽，且隨著花露體積的增加，抗氧化能力線性上升。

圖5 加樣體積對TRAP 值的影響Fig.5 The effect of sample volume on TRAP value

4 結論與討論

綜上所述，睡蓮花露主要成分包括D-葡萄糖酸、硫代異鼠李糖甘油二酯、威嚴仙皂苷C、二氫葉酸還原酶抑制劑、槲皮素、葡萄糖醛酸、肌醇半乳糖苷、3-（8-二氧基）苯酚、香豆素等多種化合物質，大多數為酚酸類、萜類、酯類、黃酮類、多糖類以及氨基酸和維生素類物質。通過3 種方法對睡蓮花露抗氧化能力的測定得到：DPPH 法中，睡蓮花露對DPPH 自由基的清除率達到85%；FRAP 法中，2 mL 的睡蓮花露的抗氧化能力相當于6.35 mmol/L 的FeSO4；TRAP 法中，5 μL 睡蓮花露的抗氧化能力相當于1.425 2 mmol/L 的抗壞血酸鈉，綜合來看，睡蓮花露的抗氧化能力較強。

睡蓮花露的主要成分中葡萄糖醛酸屬于多糖類物質，是葡萄糖的氧化產物，是肝臟解毒的物質之一，具有重要的生物活性[18]。槲皮素屬于黃酮醇類物質[19]，具有抗氧化、降血壓、抗癌殺菌等多種生物活性[20]。另外成份中含有的威嚴仙皂苷、大豆皂苷等皂苷類物質，具有溶血，降低血脂等藥用功能[21]。另外成分里的香豆素（coumarin），其衍生物具有抗氧化、抗癌等多種生理活性[22]。因此從成分上來看，睡蓮花露具備較多的生物活性，也有一定的抗氧化能力。

DPPH 法可以測定提取物中的黃酮類、酚類、萜類等有效成分的抗氧化活性，包括多種植物所含的多糖和揮發(fā)性油的抗氧化活性[23]。由試驗結果知，350 μL 睡蓮花露對DPPH 自由基的清除率為（85.19±1.55）%，與100 μL 的1 g/mL 淫羊藿提取液抗氧化性大小相當[10]，具有較強的抗氧化作用。

FRAP 法的試驗原理是Fe3+與TPTZ 溶液結合后可被樣品中還原性物質還原為Fe2+的形式，并且溶液會變成藍色，在593 nm 處吸光值達到最大。試驗結果可知：睡蓮花露抗氧化能力相當于6.35 mmol/L 的FeSO4的抗氧化能力，已有研究表明濃度10%左右的鮮棗的果肉FRAP 值為6.98±0.29，濃度10%獼猴桃的果肉FRAP 值為4.38±0.20[13]，由此可以看出，睡蓮花露的抗氧化性與鮮棗果肉和獼猴桃果肉這類高維生素C含量的水果相當，具有較強的抗氧化能力。

TRAP 法是通過樣品的抗氧化成分與ABTS 穩(wěn)定的自由基反應后的溶液在735 nm 處的吸光值會變小，以抗壞血酸鹽作為標準參照，從而定量測出其總的抗氧化值，即TRAP 值越大，表示抗氧化能力越大。試驗得到5 μL 的睡蓮花露測得TRAP=1.425 2，相當于1.425 2 mmol/L 的抗壞血酸鹽。研究表明，市場上銷售的新鮮啤酒，其80 μL 的加入量得到TRAP=1.056[16]，可知睡蓮花露的抗氧化能力強于啤酒。同時試驗顯示TRAP 值與花露加入量有很強的線性關系，且需要的加入的樣品量較低，因此可以作為未來檢測睡蓮花露抗氧化能力的有效方法。

需要注意的是，睡蓮花露中檢測出了馬來酸甲麥角新堿[24]，該成分是麥角新堿的半合成衍生物，對子宮平滑肌有高度選擇性，可用于產后或流產后預防和治療由于子宮收縮無力或縮復不良所致的子宮出血，因此睡蓮花露還有用于制造該類藥物的開發(fā)潛力。因其特殊的藥理作用，在開發(fā)花露食品時，應進一步確定其精確的含量，并考慮孕婦、冠心病、妊娠中毒癥及高血壓病患者禁止飲用。