陳雪，劉金福，2，*，張業(yè)尼，魏雅楠

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

南瓜多糖（pumpkin polysaccharide，PP）是南瓜中的主要活性成分，它可以清除機體在代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基（-OH）[1]，具有降低膽固醇、保護視力、防癌、抗癌等作用，是理想的保健食品原料[2]。人參皂苷Rg1 是人參有效成份之一，也是鑒定人參的主要成份之一。它具有促智、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤和提高免疫力等作用[3-4]。南瓜多糖和人參皂苷Rg1 分子結(jié)構(gòu)有本質(zhì)的區(qū)別，分子量大小不一，都具有抗氧化活性，有研究證明，南瓜多糖、普洱茶褐素、葛根黃酮提取物兩兩聯(lián)合可增加Nrf2 蛋白及其下游抗氧化蛋白HO-1 的表達，從而可以更好地發(fā)揮其抗氧化作用，保障機體正常代謝[5]。原人參三醇（protopanaxatriol，PPT）與Rb1 或Rg1 的聯(lián)合具有協(xié)同抗氧化活性，能協(xié)同提高抗氧化應(yīng)答元件（antioxidant response element，ARE）活性、促進Nrf2 蛋白和mRNA 的表達，調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路介導(dǎo)的抗氧化途徑[6]。將兩種或以上活性成分聯(lián)合使用，往往可以起到聯(lián)合增效作用。本試驗在建立氧化應(yīng)激細胞模型的基礎(chǔ)上，研究南瓜多糖與人參皂苷Rg1 的單一作用效果，以及將這兩種物質(zhì)聯(lián)合使用，對細胞活力和不同抗氧化指標進行測定，探討兩種物質(zhì)在抗氧化方面的聯(lián)合作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜多糖：天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院實驗室自制（純度92.5%）；人參皂苷Rg1（純度98%）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）：北京索萊寶科技有限公司；清潔型昆明種雄性小鼠（24 g～26 g）、基礎(chǔ)飼料：北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；過氧化氫（分析純）；北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗儀器

紫外-可見分光光度計（722 型）：上海菁華科技儀器有限公司；全自動酶標儀（Bio-Tek ELX800 型）：美國寶特公司；立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R 型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋（HWS28 型）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱（3111 型）：美國Thermo Forma 公司；超凈工作臺（SW-OJ-2FD 型）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；臺式低速離心機（TD5A-WS 型）：湘儀公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝細胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立與分組

1.3.1.1 肝細胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立

取雄性小鼠，將其斷頸致死，置于超凈臺上，用碘酒輕輕擦拭腹部，解剖取肝臟，置于冰中，整個操作需無菌污染；將肝臟用無菌PBS 沖洗3 次；將肝臟剪成大約1 cm3大小，無菌PBS 溶液沖洗3 次，經(jīng)200 目篩得細胞懸液，600 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀物加培養(yǎng)液吹打混勻，800 r/min 離心10 min，洗滌兩次。用血球計數(shù)板測定細胞活率及細胞密度。用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為5×106/mL，肝細胞活力大于90%。將上述肝細胞懸液于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，肝細胞全部貼壁生長，供試驗用。建立氧化應(yīng)激模型時，細胞存活率通常在50%～70%范圍內(nèi)[7-8]。若細胞的存活率過高，無法造成明顯的氧化損傷，而細胞存活率過低，則引起不可逆損傷，均不利于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。當400 μmol/L 的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)12 h 時，細胞存活率為61.2%，故選擇400 μmol/L 的H2O2作為最佳誘導(dǎo)濃度。

1.3.1.2 肝細胞氧化應(yīng)激損傷模型的分組

取上述貼壁生長的肝細胞，分別設(shè)為正常組（NG），H2O2模型組（MG），濃度分別為0.333、0.667 mg/mL 和1 mg/mL 3 個劑量的南瓜多糖組（PP），分別為PP-1，PP-2，PP-3；和人參皂苷Rg1 組（Rg1），分別為Rg1-1，Rg1-2，Rg1-3；以及南瓜多糖與人參皂苷的聯(lián)合組（JG），分別為JG-1，JG-2，JG-3；每組3 個平行，置于6 孔板中，分別加入H2O2400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3.2 細胞活性檢測

MTT 法測定細胞活性。

1.3.3 指標的測定

各孔加入500 μL 含有PMSF（苯甲基磺酰氟）的裂解液冰浴裂解10 min，收集裂解液，4 ℃下12 000 r/min，離心10 min，取上清液，采用試劑盒分別測定MDA、GSH-Px、SOD 和CAT 的含量。

1.3.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，p<0.05 表示差異顯著，p<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PP、Rg1、JG對細胞活性的影響

PP、Rg1、JG 對細胞活性的影響如圖1所示。

由圖1可以看出，小鼠肝細胞受H2O2刺激后，經(jīng)MTT 法檢測出的吸光度值明顯降低，說明細胞活力降低，而添加PP、Rg1 及JG 可以不同程度地緩解氧化損傷，細胞活力增強。

與模型組相比，添加PP-1 后，細胞活力升高，與PP-2 差異并不顯著，但是顯著高于MG（p＜0.05），而PP-3 的細胞活力升高，并且明顯高于MG（p＜0.05）。Rg1-1 與模型組差異不顯著（p＞0.05），Rg1-2、Rg1-3的細胞活力顯著高于MG（p＜0.05）。JG-1 濃度下，細胞活力與PP-1 沒有顯著性差異，但是顯著高于MG 與Rg1-1（p＜0.05）；JG-2 的細胞活力升高，與PP-3 差異不顯著（p＞0.05）；而JG-3 的細胞活力與MG 有極顯著差異（p＜0.01），接近于NG。

實驗發(fā)現(xiàn)PP、Rg1 與JG 濃度越高，細胞活力越高，具有量效關(guān)系。同濃度下，JG 與同濃度的單一作用相比，細胞活力效果最佳，表現(xiàn)出了良好的聯(lián)合增效作用。

2.2 PP、 Rg1、JG對細胞模型MDA 含量的影響

PP、Rg1、JG 對細胞模型MDA 含量如圖2所示。

圖2 南瓜多糖和人參皂苷及其聯(lián)合對細胞模型MDA 的影響Fig.2 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside and their combination on the cell model MDA

細胞脂質(zhì)過氧化程度可以用丙二醛（MDA）水平來表示。圖2顯示，正常小鼠肝細胞培養(yǎng)液中MDA 含量為（0.314 1±0.015 0）nmol/mgHb，經(jīng)H2O2刺激后，MDA含量為（8.962 1±0.099 1）nmol/mgHb，顯著升高（p＜0.05），說明肝細胞受到氧化應(yīng)激損傷。

加入PP 與Rg1 的細胞其MDA 水平顯著下降（p＜0.05），并具有顯著的量效關(guān)系，表明二者均能在一定程度上減輕細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化，保護細胞對抗氧化應(yīng)激狀態(tài)；當PP 與Rg1 聯(lián)合使用時，細胞的MDA水平較MG 顯著降低（p＜0.01），與單一成分作用相比，JG 細胞的MDA 水平均顯著低于同濃度的單一處理組（p＜0.05），呈現(xiàn)出良好的聯(lián)合增效作用。

2.3 PP、Rg1、JG對細胞模型GSH-PX 活力的影響

PP、Rg1、JG 對細胞模型GSH-PX活力影響如圖3所示。

圖3 南瓜多糖和人參皂苷及其聯(lián)合對細胞模型GSH-Px 的影響Fig.3 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside on cell model GSH-Px

如圖3顯示，添加PP 的細胞其GSH-Px 活性顯著上升（p＜0.05），隨著濃度增大活力逐漸增強，但PP-1與PP-2 的差異并不顯著；而PP-3 顯著高于MG（p＜0.05），Rg1 的GSH-PX 活性顯著上升（p＜0.05），量效關(guān)系顯著；當聯(lián)合使用時，JG-3 細胞的GSH-PX 活性較MG 顯著增強（p＜0.01），劑量效應(yīng)關(guān)系顯著，且JG 細胞的GSH-PX活性均顯著高于同濃度下的單一作用組（p＜0.05），具有聯(lián)合增效作用。

2.4 PP、Rg1、JG對細胞模型SOD 活力的影響

PP、Rg1、JG 對細胞模型SOD 活力影響如圖4所示。

圖4 南瓜多糖和人參皂苷及其聯(lián)合對細胞模型SOD 的影響Fig.4 Effect of pumpkin polysaccharide and ginsenoside on cell model SOD

圖4顯示，添加PP 的細胞其SOD 活性顯著升高（p＜0.05），隨著濃度增大活力逐漸增強，但PP-1 活力低于MG，而PP-2、PP-3 顯著高于模型組（p＜0.05）；Rg1-2、Rg1-3 的SOD 活性顯著上升（p＜0.05），Rg1-1活力低于MG，與PP-1 差異不顯著；聯(lián)合作用時，JG-1與MG 差異不顯著，但JG-2、JG-3 細胞的SOD 活性較MG 比顯著增強（p＜0.05），具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，且JG-3 較模型組有極顯著差異（p＜0.01）。與單一作用相比，JG 細胞的SOD 活性均顯著強于同濃度的單一作用組（p＜0.05），同樣表明二者具有聯(lián)合增效作用。

2.5 PP、Rg1、JG對細胞模型CAT 活力的影響

PP、Rg1、JG 對細胞模型CAT 活力的影響如圖5所示。

圖5 南瓜多糖和人參皂苷及其聯(lián)合對細胞模型CAT 的影響Fig.5 Effects of pumpkin polysaccharide and ginsenoside and its combination on cell model CAT

圖5顯示，PP-2、PP-3、Rg1-2、Rg1-3 處理的細胞其CAT 活性顯著上升（p＜0.05），隨著濃度增大活力逐漸增強；當聯(lián)合作用時，JG-3 細胞的CAT 活性較模型組比顯著增強（p＜0.01），并具有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，JG 細胞的CAT 活性均顯著強于同濃度的單一作用組（p＜0.05），聯(lián)合增效明顯。

3 討論

本實驗應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)小鼠肝細胞，H2O2可直接進入細胞內(nèi)與各種細胞成分相互作用，產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，南瓜多糖與人參皂苷均具有一定的清除自由基能力，并且能夠起到抑制細胞凋亡，提高細胞活力和生理功能等作用[9-10]。H2O2在肝細胞內(nèi)也會轉(zhuǎn)變?yōu)椋?OH），可引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)，雙鏈脂肪酸過氧化（聚合）致MDA 增多，從而致使肝細胞膜通透性增加[10-12]。H2O2也可以使GSH-Px 等抗氧化酶活性水平下降，細胞損傷加重。對細胞氧化還原系統(tǒng)中抗氧化酶活性的提高能力常被用作考察抗氧化劑細胞保護能力的關(guān)鍵指標[13]。

本實驗采用MTT 法檢測細胞活性，選擇MDA、GSH-Px、SOD、CAT 等作為評價肝細胞氧化損傷和改善修復(fù)的指標。實驗設(shè)計不同濃度的PP 和Rg1 組對發(fā)生氧化應(yīng)激的細胞進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)細胞活力增強，可以降低肝細胞內(nèi)的MDA 含量，GSH-Px、SOD、CAT 活性升高，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，但在相同的濃度下，表現(xiàn)的強弱有所差別，可能作用靶點和反應(yīng)的通路有所不同。為了考察分子量和分子結(jié)構(gòu)差異較大的多糖和皂苷兩種物質(zhì)的聯(lián)合使用的抗氧化效果，實驗設(shè)計了與單一物質(zhì)相同濃度的聯(lián)合組（JG），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，效果增強，同樣表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，而且同濃度下的JG 在細胞活力和實驗的各項抗氧化指標上效果更好，表現(xiàn)出明顯的聯(lián)合增效現(xiàn)象，可能通過不同靶點和通路的協(xié)同聯(lián)動機制發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

南瓜多糖與人參皂苷以及它們的聯(lián)合使用均能顯著提高H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細胞的活力，能顯著降低細胞MDA 水平，減輕細胞脂質(zhì)過氧化損傷，通過提高細胞SOD、GSH-Px 和CAT 的活性，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，改善細胞氧化應(yīng)激損傷。兩種物質(zhì)聯(lián)合使用效果更加明顯，起到了聯(lián)合增效作用。