孫夢瑩，焦煕棟，李新玲，妥彥峰，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，烏魯木齊新疆830000）

防腐劑是一種能防止食品腐敗變質(zhì)的食品添加劑，主要原理就是抑制食品中微生物的繁殖[1]。乳酸菌是一大類發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的兼性厭氧菌，許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰外，還可以產(chǎn)生一些具有抑菌性能的細(xì)菌素，這些物質(zhì)不僅能保持食品的風(fēng)味還可以抑制食品腐敗菌的生長，在食品防腐保鮮方面起著重要的作用[2-3]。乳桿菌屬細(xì)菌是乳酸菌屬中最為重要的菌屬，作為一種安全的益生菌，乳酸菌大量的分布在海洋魚類的腸道中，可以增強(qiáng)動(dòng)物包括魚在內(nèi)的機(jī)體免疫反應(yīng)和生長[19]，近年來關(guān)于魚腸道乳酸菌的分離以及抑菌物質(zhì)研究、乳桿菌食品防腐保鮮逐漸成為熱點(diǎn)。

李曉婷等[4]研究發(fā)現(xiàn)ALAC-1 和ALAC-4 兩株乳桿菌對黃曲霉具有良好的抑菌作用，其菌株代謝產(chǎn)物中的蛋白類、有機(jī)酸等物質(zhì)可以抑制霉菌的生長；杜琨[5]研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的保鮮劑可提高冷卻豬肉在冷藏過程中的保鮮效果，延長冷卻豬肉的保質(zhì)期。馬歡歡等[6]研究表明，Lb.plantarumDL3 對黑曲霉的抑制率高達(dá)92.28%，發(fā)現(xiàn)其對黑曲霉的抑菌作用主要通過破壞黑曲霉孢子的完整性，從而抑制其生長、繁殖。劉佳秀等[22]發(fā)現(xiàn)海洋魚類來源的L.plantarumY12 具有抑制魚肉中腐敗菌的生長、防止魚肉腐敗的功能。

本文主要采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法研究從4種海魚（鲅魚、大黃魚、梭魚和鴉片魚）腸道中分離出的乳桿菌代謝產(chǎn)物對幾種常見的食品腐敗菌的拮抗效果，旨在篩選出拮抗活性較強(qiáng)的乳桿菌菌株，并初步判定出菌株產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)屬于哪類物質(zhì)，能加速人類對海洋源乳酸菌資源的開發(fā)和利用，對海洋源乳酸菌將來在乳制品、蔬菜、飼料、肉制品的發(fā)酵以及食品的防腐保鮮中的應(yīng)用都有指導(dǎo)的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海魚：大連市內(nèi)海鮮商行；試驗(yàn)所用6種腐敗菌大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes），志賀氏菌（Shigella Castellani）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）標(biāo)準(zhǔn)菌株：大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株；MRS 瓊脂、MRS 肉湯、LB 營養(yǎng)肉湯、LB瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胃蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、乙酸鈉：天津石英鐘廠霸州市化工分廠；30 %過氧化氫、無水葡萄糖、磷酸氫二鉀、MnSO4·4H2O：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；MgSO4·7H2O：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫通風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5804R 型冷凍離心機(jī)：Eppendorf 中國有限公司；AW200SG 型厭氧工作站：英國ELECTROTEK 公司；SX-500 型全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology 公司；PL303 型電子分析天平、S210-K 型SevenCompact pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；V-1100D 型可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SL-II 型層析實(shí)驗(yàn)冷柜：寧波新芝生物科技股份有限公司；L320 生物光學(xué)顯微鏡：深圳市西派克光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海魚腸道菌株分離

超凈工作臺(tái)內(nèi)，用70%酒精擦拭海魚魚體表面解剖海魚胃腸道、無菌剪刀剪碎置于無菌研缽中，加入0.85%滅菌的生理鹽水15 mL，研磨3 min，形成勻漿液，吸取1 mL 溶液作為海魚腸道原液。取0.1 mL 原液加入0.9 mL 0.85%的無菌生理鹽水試管中，進(jìn)行梯度稀釋，吸取100 μL 的稀釋液于MRS 固體培養(yǎng)基上涂布，30°C 厭氧培養(yǎng)48 h，直至形成單個(gè)菌落。

挑選菌落形態(tài)良好的單菌落置于5%過氧化氫溶液的載玻片中，進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)[7]。0.5 min 內(nèi)產(chǎn)生氣泡的為過氧化氫酶陽性細(xì)菌、反之為過氧化氫酶陰性細(xì)菌。

對過氧化氫酶陰性菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌株顏色，菌株呈現(xiàn)藍(lán)紫色為革蘭氏陽性細(xì)菌（G+）、呈現(xiàn)紅色為革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）[18]。

以過氧化氫酶試驗(yàn)陰性、革蘭氏染色陽性的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，篩選具有抑菌活性的乳桿菌。

1.3.2 初篩乳桿菌的抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[8]進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，牛津杯直徑為8 mm，以抑菌圈的平均直徑±標(biāo)準(zhǔn)誤差來描述菌株抑菌能力的強(qiáng)弱。

取0.1 mL 乳桿菌菌液接種于5 mL MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代2 次后于4 ℃保存待用。取0.1 mL 大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌屬和金黃色葡萄球菌菌液接種于5 mL LB 肉湯培養(yǎng)基中，0.1 mL 單增李斯特菌接種于5 mL TSA-YE 培養(yǎng)基中，傳兩代后使用。

將活化的乳酸菌發(fā)酵液4℃、8000r/min 離心10min，棄沉淀（菌體）保留上清液，并過0.22 μm 濾膜除菌，收集濾液即為乳桿菌上清液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

以大腸桿菌為指示菌，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法研究乳桿菌上清液的抑菌性能，從中初篩選出抑菌活性較強(qiáng)的幾株乳桿菌株。

同樣采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法研究初篩乳桿菌對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的抑菌效果。

1.3.3 乳桿菌代謝產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的確定

1.3.3.1 排除有機(jī)酸試驗(yàn)

選取革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌來作為指示菌，篩選出具有抑菌活性的乳桿菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。首先排除有機(jī)酸的干擾，用1 mol/L 的NaOH 中和菌株上清液中的有機(jī)酸，將pH值調(diào)至空白MRS 的pH值，并采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，1 號(hào)孔加入正常的發(fā)酵上清液，剩下3 個(gè)孔加入中和酸后的上清液。

1.3.3.2 排除過氧化氫試驗(yàn)

若證明了乳桿菌代謝產(chǎn)物不完全是有機(jī)酸在起作用，則需要進(jìn)行過氧化氫作用的排除試驗(yàn)，試驗(yàn)中將離心獲得的乳桿菌發(fā)酵上清液在80 ℃水浴鍋中加熱10 min 使過氧化氫充分分解后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[9]。試驗(yàn)中以未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液作為對照。

1.3.3.3 蛋白酶敏感性試驗(yàn)

分別用中性蛋白酶和胃蛋白酶處理發(fā)酵上清液[10]。用1 mol/L NaOH 調(diào)上清液pH值至中性蛋白酶最適pH 7.0，控制加酶量0.5 mg/mL，37 ℃水浴2 h 后，再用1 mol/L HCl 調(diào)pH值至發(fā)酵液原pH值進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，而胃蛋白酶處理的樣品不需要調(diào)整pH值。試驗(yàn)過程中以未經(jīng)蛋白酶處理的乳桿菌上清液作對照。如果僅為驗(yàn)證在酸性條件下才起作用的細(xì)菌素，則只需要將上清液用胃蛋白酶進(jìn)行處理。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用IBM SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較所得數(shù)據(jù)之間的顯著差異性（P<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 海魚腸道菌株的篩選

海魚腸道菌株的鏡檢及過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知從黃魚、鴉片魚、鲅魚和梭魚4種海魚腸道中篩選出的41 株菌株全部為革蘭氏陽性菌，其中包括21 株桿菌和20 株球菌，通過過氧化氫酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21 株桿菌全部為過氧化氫酶試驗(yàn)陰性菌，因此初步認(rèn)定乳桿菌屬細(xì)菌，在剩下的20 株球菌中，菌株B2-11 為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性菌株，因此可以排除其為乳酸菌屬細(xì)菌的可能，其余的球菌則可能是乳酸球菌屬、鏈球菌屬或腸球菌屬細(xì)菌。通過對21 株桿菌菌落形態(tài)以及其在顯微鏡下染色后形態(tài)的觀察，最終篩選了16株桿菌作為后續(xù)的研究菌株，部分桿菌在顯微鏡下的菌體形態(tài)見圖1。

表1 海魚腸道菌株的鏡檢及過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Microscopic examination of intestinal strains of sea fish and results of catalase test

2.2 高抑菌性乳桿菌的篩選乳桿菌發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌效果見表2。

由表2可看出，從梭魚腸道中分離得到的菌株S2-6 抑菌作用最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到了14.77 mm，而菌株S3-2 拮抗作用較弱，抑菌圈直徑只有8.64 mm，而菌株S2-4，Y3-1，B2-3，B2-4，B2-10 和H2-4 也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，其余菌株的抑菌直徑則沒有超過12.50 mm。整個(gè)試驗(yàn)過程均以無細(xì)胞發(fā)酵上清液來作為抑菌物質(zhì)，結(jié)果表現(xiàn)出了一定程度的抑菌性，表明抑菌物質(zhì)主要存在于菌株的無細(xì)胞代謝產(chǎn)物中，這一結(jié)果與茍小蘭等[11]的研究結(jié)果相類似，都表明乳酸菌的抑菌物質(zhì)主要存在于代謝產(chǎn)物中，菌體本身并沒有抑菌作用。從梭魚中選出的S2-4，S2-6，鴉片魚中選出Y3-1，鲅魚中選出B2-4，B2-10 和海魚H2-4 作為抑菌性較強(qiáng)的高抑菌性乳桿菌菌株，進(jìn)行后續(xù)的研究菌株。

圖1 幾株桿菌在顯微鏡下的菌體狀態(tài)Fig.1 The bacterial status of several strains of bacteria under the microscope

表2 16株乳桿菌發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of 16 Lactobacillus fermentation broth on Escherichia coli

2.3 高抑菌性乳桿菌的抑菌試驗(yàn)

采用同樣的方法研究了篩選出的6株乳桿菌對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌這五種指示菌的拮抗效果。試驗(yàn)中同樣將指示菌的菌密度控制為OD600=0.4±0.05，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6株乳桿菌對所有選取的食品腐敗菌都有一定的拮抗作用，抑菌圈直徑大小見表3。

表3 乳桿菌發(fā)酵液對拮抗菌株的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of Lactobacillus fermentation broth on antagonistic strains

從表3中可以看出菌株S2-6 和Y3-1 的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌這五種食品腐敗菌均有較強(qiáng)的抑制效果且抑菌圈直徑都大于14 mm，其中菌株S2-6對沙門氏菌的抑菌圈直徑最大達(dá)到了16.45 mm，菌株Y3-1 對志賀氏菌的抑菌圈直徑也達(dá)到了16.61 mm。此外菌株B2-4 對沙門氏菌，志賀氏菌和副溶血性弧菌3種革蘭氏陰性菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別達(dá)到15.32、15.61、15.52 mm，對另外兩株革蘭氏陽性菌株的抑菌圈直徑則在13.00 mm 左右，因此菌株B2-4 對革蘭氏陰性菌的抑菌性能可能要強(qiáng)于革蘭氏陽性菌。雖然每株桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能相同，對不同的指示菌，6株乳桿菌會(huì)表現(xiàn)出不同的抑制效果，6株乳桿菌都對沙門氏菌和副溶血性弧菌有較強(qiáng)的抑菌效果，其抑菌圈直徑都較其它食品腐敗指示菌大，平均直徑都在15.00 mm 左右。但是菌株S2-4 對志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用卻不是很明顯，抑菌圈直徑只有9.91 mm 和8.35 mm，都沒有超過10 mm。

2.4 乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)的研究

2.4.1 排除有機(jī)酸試驗(yàn)

乳桿菌在代謝過程中可產(chǎn)生有機(jī)酸，有機(jī)酸可能是抑菌的主要物質(zhì)，試驗(yàn)中將6株桿菌傳代培養(yǎng)并離心獲得上清后，測得其上清液pH值均在3.5～4.0 之間，之后用1 mol/L 的NaOH 中和上清液代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸，將pH值調(diào)至空白MRS 的pH值，同時(shí)用未調(diào)pH值的上清液作為對照，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，如表4。

表4 排除有機(jī)酸試驗(yàn)的抑菌效果Table 4 Eliminate the antibacterial effect of organic acid test

表4表明，所有經(jīng)過中和有機(jī)酸后的試驗(yàn)組，無論對大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌均未產(chǎn)生明顯的抑菌圈，而未經(jīng)中和的上清液均顯示出抑菌圈。這說明乳桿菌發(fā)酵上清液中可能是代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸在充當(dāng)抑菌物質(zhì)，Vazquez 等研究9 株不同來源的乳酸菌對致病菌有抑制作用，認(rèn)為乳酸菌主要通過分泌乳酸、乙酸等有機(jī)酸來抑制病原菌的生長[21]。上清液中還可能存在一些特殊細(xì)菌素，它們只在酸性條件下發(fā)揮抑菌作用，因而未能在上述試驗(yàn)條件下表現(xiàn)出抑菌效果，所以要用能在酸性條件下發(fā)揮作用的胃蛋白酶處理上清液以驗(yàn)證是否有細(xì)菌素的存在。

2.4.2 蛋白酶敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)過程中通過對乳桿菌發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白酶處理，來驗(yàn)證上清液抑菌物質(zhì)中是否含有蛋白類細(xì)菌素。排除有機(jī)酸試驗(yàn)已經(jīng)說明本試驗(yàn)只需要使用胃蛋白酶對發(fā)酵上清液進(jìn)行酶解，檢測酶處理后的上清液是否還有抑菌能力，蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 排除乳桿菌發(fā)酵液中蛋白后的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of removing protein from Lactobacillus fermentation broth

由表5可以看出菌株S2-6、Y3-1 和B2-10 經(jīng)胃蛋白酶處理后的發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑菌圈顯著變?。≒<0.05），對金黃色葡萄球菌抑菌效果不明顯，而菌株S2-4 在處理前后對兩種致病菌的抑菌效果均不明顯；經(jīng)蛋白酶處理后的菌株H2-4 對兩種致病菌均有顯著的抑菌效果（P<0.05），推測H2-4 可能為一種產(chǎn)廣譜蛋白類抑菌物質(zhì)的乳酸菌株，其抑菌結(jié)果如圖2.5所示。雖然初步判定出了這幾株桿菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，但是菌株產(chǎn)生的蛋白類抑菌物質(zhì)需要進(jìn)一步的分離純化，其結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)也有待于進(jìn)一步深入的研究，以方便人們對海洋源乳酸菌蛋白類抑菌物質(zhì)的開發(fā)和利用，推動(dòng)細(xì)菌素在食品保鮮方面的應(yīng)用。

2.5 乳桿菌菌株的鑒定

本試驗(yàn)所分離的乳桿菌株均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌的16S rDNA 序列測定。6株菌株的相似性及NCBI 登錄號(hào)如表6所示。

表6 6株乳桿菌株的NCBI 參考結(jié)果Table 6 NCBI reference results of 6 strains of Lactobacillus

由表6可知，菌株B2-4、H2-4、S2-4 被鑒定為米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），菌株S2-6 和Y3-1 被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。但是從鲅魚腸道分離的B2-10 卻被鑒定為灰黃色腸球菌（Enterococcus gilvus）或 病 臭 腸 球 菌（Enterococcus malodoratus），這兩株菌都屬于同種的鳥腸球菌群。

現(xiàn)篩選的菌株B2-10 被鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）細(xì)菌，該屬細(xì)菌也是革蘭氏陽性、無芽孢的過氧化氫酶試驗(yàn)陰性菌，但是腸球菌不屬于本試驗(yàn)旨在篩選的乳桿菌屬細(xì)菌，造成這一結(jié)果的主要原因是由于腸球菌屬細(xì)菌多為圓形或橢圓形，成對或短鏈狀排列，并且一些細(xì)菌可能處于分裂狀態(tài)，其形態(tài)易與短桿菌相混淆，以致鏡檢時(shí)將其誤認(rèn)為是乳桿菌屬細(xì)菌，現(xiàn)將其糾正為腸球菌屬細(xì)菌。

周偉等[12]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌素L-1 能抑制單增李斯特菌的生長，不過近幾年發(fā)現(xiàn)一些植物乳桿菌素也能抑制革蘭氏陰性菌的生長。這和本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的S2-6 和Y3-1 兩株植物乳桿菌對革蘭氏陰性菌大腸桿菌有抑制作用結(jié)果相一致，洪偉等[13]也曾從腌菜中分離出一株能拮抗大腸桿菌的植物乳桿菌，董雪鳳等[20]也認(rèn)為乳酸菌對大腸桿菌有明顯的抑制作用，其抑制作用的強(qiáng)弱與乳酸菌活力和大腸桿菌的濃度有關(guān)，這些結(jié)果為今后深入的研究和利用植物乳桿菌素奠定了一定的基礎(chǔ)。此外本試驗(yàn)還從鲅魚、黃魚和梭魚腸道中各分離出了一株米酒乳桿菌，編號(hào)依次為B2-4、H2-4 和S2-4。米酒乳桿菌主要分布在酸泡菜[14]、發(fā)酵面團(tuán)、發(fā)酵香腸[15]等發(fā)酵食品中，本試驗(yàn)從海魚腸道中分離出米酒乳桿菌實(shí)在為少見。但是關(guān)于米酒乳桿菌素C2 的研究卻很多[12，16]，劉曉燕等[17]研究發(fā)現(xiàn)米酒乳桿菌素C2除了具有很好的穩(wěn)定性外，還能對金黃色葡萄球菌起到抑制作用，這與本試驗(yàn)分離得到米酒乳桿菌B2-4 性質(zhì)極為相似。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從梭魚和鴉片魚腸道中各分離出一株植物乳桿菌S2-6 和Y3-1，能夠在代謝中產(chǎn)生蛋白類抑菌物質(zhì)，可抑制大腸桿菌的生長；從海魚中獲得的米酒乳桿菌H2-4 產(chǎn)生的細(xì)菌素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生抑制效果，因此推測其可能是一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的米酒乳桿菌，而這些細(xì)菌素也需要于進(jìn)一步深入的研究和純化。從海魚中分離具有廣譜抑菌性能的乳酸菌，可作為潛在的生物保鮮劑應(yīng)用于海洋魚類的保鮮。