鄒俊哲，林凱，楊旭，譙飛，韓雪，劉紅彥，楊艷艷，劉漢民，張?zhí)m威，5，*（.中國(guó)海洋大學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中心，山東青島6600；.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱50090；.哈爾濱市食品工業(yè)研究所有限公司，黑龍江哈爾濱50090；.中恩（天津）營(yíng)養(yǎng)科技有限公司，天津00000；5.華羚生物技術(shù)研究中心，甘肅蘭州70000）

高血壓是引起心腦血管疾病的元兇之一，它對(duì)人體的心腦血管和腎臟等器官具有較大損傷[1]。因此，研制能夠有效預(yù)防和治療高血壓的降壓藥物或保健食品已成為研究熱點(diǎn)[2]。其中食源性血管緊張素-I 轉(zhuǎn)換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽因其溫和、高效以及無(wú)副作用而倍受青睞。ACE 又稱肽基-羧基肽酶，廣泛存在于人體各種器官中，其主要作用是將血管緊張素I（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）C 端的兩個(gè)氨基酸（His-Leu）水解生成血管緊張素II（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）。血管緊張素II 是強(qiáng)有效的升壓物質(zhì)，從而使血壓升高。同時(shí)，ACE 能夠?qū)е率沟醚苁鎻埖氖婢徏る氖Щ?，從而進(jìn)一步加劇血壓的升高[3]。研究表明，ACE 的底物轉(zhuǎn)移性較差，很多具有與血管緊張素I 結(jié)構(gòu)類似的多肽都能夠與ACE 發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而使ACE 活性降低，阻止血壓升高[4]。

許多蛋白質(zhì)序列中含有與血管緊張素I 結(jié)構(gòu)類似的多肽序列。目前，研究主要利用蛋白酶對(duì)各種蛋白進(jìn)行水解，通過(guò)對(duì)獲得的水解物進(jìn)一步分離純化，考察各組分的ACE抑制活性，從而獲得新型ACE抑制肽。有研究已經(jīng)通過(guò)對(duì)油菜籽蛋白[5]、大豆蛋白[6]和蘑菇[7]等不同蛋白進(jìn)行水解，分離純化獲得了多種具有ACE抑制活性的多肽片段。同時(shí)，也有研究利用乳酸菌水解植物蛋白制備具有ACE抑制活性水解物的研究[8]。蛋白酶及菌體發(fā)酵均能夠水解蛋白產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)，但很少有將蛋白酶與菌體發(fā)酵相結(jié)合用于制備功能性多肽的研究。蛋白酶與菌體結(jié)合可能會(huì)互補(bǔ)對(duì)方在水解方面的不足，從而制備獲得新型生物活性肽。

本研究通過(guò)植物乳桿菌2-18 與風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶/酸性蛋白酶協(xié)同作用，制備腎病患者專用低蛋白大米，對(duì)獲得的富含多肽的大米蛋白脫除液進(jìn)行多步分離純化，最終獲得具有高ACE抑制活性的多肽片段，并采用液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）測(cè)定其氨基酸序列，驗(yàn)證其ACE抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用大米購(gòu)于天津市寶坻區(qū)喜旺米加工有限公司；枯草芽孢桿菌Y（Bacillus subtilisY）、枯草芽孢桿菌Y4-2（Bacillus subtilisY4-2）由哈爾濱工業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；胃蛋白酶：美國(guó)Sigma 公司；菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；ACE（1 UN）：Sigma 公司；蛋白純化系統(tǒng)：美國(guó)GE 公司，液質(zhì)聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass LC-MS）：美國(guó)Agilent 公司；3-30K 高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma 公司，生物發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程，Millipore8400 超濾杯：美國(guó)密理博公司。

1.2 菌酶組合發(fā)酵水解大米蛋白

將植物乳桿菌2-18 預(yù)先活化2 次，按總體系的5 %（體積分?jǐn)?shù)）接種于大米水溶液中，于發(fā)酵罐中40 ℃30 r/min 條件下發(fā)酵9 h，使用200 目濾布過(guò)濾收集濾液。用等量蒸餾水清洗經(jīng)乳桿菌處理后的大米，調(diào)整大米發(fā)酵液pH值至1.5，加入0.3%（E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胃蛋白酶/酸性蛋白酶，控制溫度為40 ℃30 r/min條件下發(fā)酵18 h，過(guò)濾收集濾液，用等量蒸餾水清洗大米；調(diào)整大米發(fā)酵液pH值至6.8，溫度為45 ℃，加入0.3%（E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶，于45 ℃30 r/min 條件下發(fā)酵18 h，過(guò)濾收集過(guò)濾液，用蒸餾水清洗大米。將乳桿菌2-18 發(fā)酵液與兩次蛋白酶酶解液收集合并，經(jīng)8 000 r/min 離心10 min，去除菌體和顆粒等雜質(zhì)。將上清液通過(guò)3 kDa 的超濾膜，收集透過(guò)液。最后經(jīng)冷凍干燥后，將樣品置于-20 ℃?zhèn)溆?。采用凱氏定氮法測(cè)定大米蛋白脫除率[9]。

1.3 ACE抑制活性的測(cè)定

ACE抑制率測(cè)定步驟如下[10]：取25 μL 樣品，然后加125 μL 的馬尿酰組氨酸亮氨酸（N-hippuril-Lhistidy-L-leucine，HHL），在37 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加入20 μL 的ACE（0.1 U/mL），37 ℃孵育1 h，然后加入350 μL 1 mol/L 的HCl 溶液以終止反應(yīng)。向試管中加入1.7 mL 乙酸乙酯萃取生成的馬尿酸，旋渦震蕩15 s，在4 000 r/min 的條件下離心5 min，然后取上層液1 mL于120 ℃烘干，冷卻后加入1 mL 水溶解，超聲5 min，最后在228 nm 處測(cè)吸光值，以水作為空白對(duì)照。ACE抑制劑的活性通過(guò)下式計(jì)算：

其中A為空白組（即將25 μL 樣品換成緩沖液）吸光值，B為樣品組吸光值，C為ACE 失活組（即在加入ACE 之前先加入350 μL HCl，使ACE 失活）吸光值。采用BCA 測(cè)定試劑盒測(cè)定濾液中多肽含量。

1.4 大米蛋白發(fā)酵水解液中ACE抑制肽的分離純化

將經(jīng)植物乳桿菌2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶處理后的大米蛋白發(fā)酵水解液經(jīng)如下步驟進(jìn)行分離純化。

1.4.1 陽(yáng)離子交換色譜層析

首先，選用陽(yáng)離子交換層析柱進(jìn)行分離純化[11]。陽(yáng)離子交換層析條件：離子交換柱選擇SP Sepherose Fast Flow（1.6 cm×20 cm），裝柱后經(jīng)20%的乙醇、磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L 的NaCl）沖洗，再用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）平衡層析柱。上樣量為100 mL，用磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L NaCl）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為2 mL/min，每管收集5 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。測(cè)定具有吸收峰管數(shù)的收集液的ACE抑制活性，將具有最高ACE抑制率的組分進(jìn)行收集，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后進(jìn)一步分離純化。

1.4.2 凝膠色譜層析

選擇分離分子量在100 Da～7000Da 之間的Superdex Peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱進(jìn)一步對(duì)上述組分進(jìn)行分離純化[12]。柱條件：先用20%的乙醇沖洗柱子，再用30%的乙腈（含0.1%三氟乙酸）平衡柱子。上樣量為0.5 mL，洗脫液為30%的乙腈（含0.1%三氟乙酸），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，每管接收1 mL。測(cè)定具有吸收峰管數(shù)的收集液的ACE抑制活性，將具有最高ACE抑制率的組分收進(jìn)行集，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后進(jìn)一步分離純化。

1.4.3 高效液相色譜分離純化

將經(jīng)凝膠層析得到的具有最高ACE抑制活性的組分用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography HPLC）進(jìn)行分離純化[13]。色譜條件為：色譜柱使用Grom-sil 120 ODS-5 ST（5 μm，10.0 mm×250 mm），使用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件為0%～50%的乙腈溶液（v/v，50 min），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集并測(cè)定具有吸收峰的組分的ACE抑制活性。

1.5 LC-MS鑒定ACE抑制肽序列

將HPLC 分離得到的具有最高ACE抑制活性的組分進(jìn)行LC-MS 分析[14]。色譜條件：Express Peptide Es-C8 柱（100 mm×2.1 mm×2.7 μm），流動(dòng)相A（0.3 %乙酸水溶液），流動(dòng)相B（含0.3%乙酸的乙腈），梯度洗脫，3%～95%的B 30 min，95%～3%的B 5 min，流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量15 μL。質(zhì)譜條件：陽(yáng)離子模式，質(zhì)量范圍m/z：100～3 200，分離電壓200 V，噴嘴電壓50V，噴霧器壓力3.4×105Pa，毛細(xì)管電壓3500 V，氣體溫度350 ℃，氣體流速12 L/min，Skimmer 60 V[10]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中Duncan's 法進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

利用植物乳桿菌2-18+風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶分步進(jìn)行大米蛋白發(fā)酵水解處理，測(cè)定蛋白脫除率為（91.32±1.6）%，對(duì)收集獲得的大米蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行分離并考察相應(yīng)組分的ACE抑制活性。

2.1 陽(yáng)離子交換色譜處理效果

離子交換層析是用來(lái)分離純化多肽的常用方法，離子柱的固定相與帶相反電荷的多肽通過(guò)庫(kù)侖力結(jié)合吸附，再用與多肽帶有相同電荷的流動(dòng)相洗脫，通過(guò)連續(xù)改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，從而將帶有不同強(qiáng)度電荷的多逐步洗脫，從而達(dá)到分離純化的目的[15]。首先，將大米蛋白發(fā)酵水解液進(jìn)行SP Sepherose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析，其分離效果如圖1（a）所示。

通過(guò)吸收峰可知，樣品初步分為3 個(gè)組分，分別為AI、AII 和AIII。對(duì)這三管進(jìn)行多肽含量和ACE抑制率的測(cè)定，圖1（b）是AI、AII 和AIII 這3 個(gè)組分的多肽含量和IC50值。其多肽含量分別為（1.22±0.048）、（1.87±0.034）、（1.98±0.053）mg/mL。IC50值分別為（0.267±0.014）、（0.355±0.013）、（0.442±0.015）mg/mL，組分AI 具有最高的ACE抑制活性。因此，將對(duì)AI 組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

2.2 凝膠色譜處理效果

將SP Sepherose Fast Flow 陽(yáng)離交換色譜層析獲得的AI 組分收集并凍干成粉末，利用Superdex peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱對(duì)該組分進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。將凍干粉配制成2 g/L 的溶液進(jìn)行分離純化。分離純化的結(jié)果如圖2（a）所示。由圖可知，通過(guò)使用凝膠色譜對(duì)AI 組分繼續(xù)進(jìn)行分離，得到了BI、BII、BIII、BIV、BV、BVI 和BVII 共7 個(gè)組分。說(shuō)明該試驗(yàn)選用的Superdex peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱能夠較好的分離小分子量多肽。試驗(yàn)測(cè)定了不同組分的多肽含量和IC50值，如圖2（b）所示。

由結(jié)果可知，組分BIII、IV 和BV 的蛋白含量較高。同時(shí)測(cè)定不同組分的ACE抑制活性可知，BI、BII和BVII 均未測(cè)的具有ACE抑制活性。BIII、BIV、BV 和BVI 具有較強(qiáng)的ACE抑制活性，其IC50值分別為（111.20±3.10）、（87.58±2.20）、54.97、133.21 μg/mL。由此可知，BV 組分具有最高的ACE抑制活性。因此，收集BV 組分，將其凍干濃縮，進(jìn)行下一步的反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography RE-HLPC）分離分析。

圖1 SP Sepherose Fast Flow陽(yáng)離子交換色譜層析分離效果及各組分的多肽含量和ACE抑制抑制活性Fig.1 The results of cationic column chromatography separation and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities

圖2 Superdex peptide 10/300 GL柱層析分離效果及不同組分的肽含量和ACE抑制IC50值Fig.2 The results of Superdex peptide 10/300 GL separation and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities

2.3 高效液相色譜

將經(jīng)冷凍干燥后的BV 組分配成的2 g/L 的多肽液，使用HPLC 對(duì)該組分進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，見(jiàn)圖3。

結(jié)果如圖3（a）所示，在16.0 min～17.5 min 和17.5 min～18.0 min 獲得了兩個(gè)分離較好的吸收峰，分別為CI 和CII 組分。收集CI 和CII 分離液并冷凍干燥后測(cè)定兩組分的多肽濃度和ACE抑制活性，結(jié)果如圖3（b）所示。由結(jié)果可知CI 的IC50值為（33.81±2.10）μg/mL，低于于CII 組分的IC50值（61.31±3.20 μg/mL）。由結(jié)果可知，CI 組分具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。試驗(yàn)將進(jìn)一步利用LC-MS 測(cè)定CI 組分的多肽序列。

圖3 RE-HPLC 分離效果及不同組分的肽含量和ACE抑制IC50值Fig.3 The result of RE-HPLC separation（a）and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities（b）

2.4 LC-MS鑒定多肽序列分析結(jié)果

LC/MS 是用來(lái)分析多肽氨基酸序列信息的常用手段，本試驗(yàn)將通過(guò)LC-MS 研究CI 組分的氨基酸序列，見(jiàn)圖4。

圖4 LC-MS 分析色譜圖及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖Fig.4 The chromatogram of LC-MS analysis and the peaks in chromatogram corresponding of the spectrum.

圖4（a）是CI 組分液相色譜圖，圖譜具有一個(gè)單峰，說(shuō)明CI 組分為單一物質(zhì)。對(duì)應(yīng)該液相色譜峰的質(zhì)譜圖如圖4（b）所示，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜峰的分析，該物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為838.445 6 Da。根據(jù)已知多肽的分子質(zhì)量和多肽來(lái)源，用于推測(cè)多肽段序列結(jié)構(gòu)已得到了廣泛的應(yīng)用[16-17]。大米蛋白主要為谷蛋白，其序列可通過(guò)UniProt 網(wǎng)站獲得，其氨基酸序列為：

MASKVVFFAAALMAAMVAISGAQLSESEMRFRDRQCQREVQDSPLDACRQVLDRQLTGRERFQPMFRRPGALGLRMQCCQQLQDVSRECRCAAIRRMVRSYEESMPMPLEQGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEGSSEEGYYGEQQQQPGMTRVRLTRARQYAAQLPSMCRVEPQQCSIFAAGQY。通過(guò)搜索該序列相對(duì)分子質(zhì)量為（838.4±2）Da的肽序列。經(jīng)過(guò)氨基酸序列比較，該多肽序列為：Val-Val-Phe-Phe-Ala-Ala-Ala-Leu。由結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該序列中的氨基酸全部為疏水性氨基酸，已有研究表明，多肽序列中含有疏水性氨基酸能夠有利于其與ACE分子催化活性中心結(jié)合，從而發(fā)揮ACE抑制作用[18]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用了植物乳酸菌2-18 協(xié)同蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶）分步脫除大米蛋白，大米蛋白脫除率可達(dá)（91.32±1.26）%。對(duì)蛋白脫除液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和REHPLC 三步分離純化，獲得了具有較高ACE抑制活性的多肽組分，并對(duì)該多肽序列進(jìn)行了LC-MS 分析，通過(guò)與大米的谷蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，確定了該ACE抑制肽序列為VVFFAAAL，其ACE抑制活性IC50值為33.81 μg/mL。本研究表明，經(jīng)菌酶組合獲得的大米蛋白發(fā)酵水解能夠作為產(chǎn)ACE抑制肽的良好原料。