楊延兵 張 涵 王潤(rùn)豐 鄧立剛 秦 嶺 陳二影 管延安

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所1，濟(jì)南 250100) (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所2，濟(jì)南 250100)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv.]又稱為粟，去殼后稱為小米，在植物學(xué)上屬禾本科狗尾草屬。它起源于中國(guó)，栽培歷史悠久，據(jù)考古學(xué)研究，距今約有一萬(wàn)多年的栽培歷史[1-2]，曾長(zhǎng)期是我國(guó)北方的主要糧食作物。它抗旱耐瘠、水分利用效率高、適應(yīng)性廣，至今在干旱和半干旱地區(qū)仍是重要的糧食作物。小米營(yíng)養(yǎng)豐富且各種成分平衡，其品質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)保健中的作用獨(dú)特，加強(qiáng)研究、發(fā)掘利用這一作物的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，對(duì)于促進(jìn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，豐富提高人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的物質(zhì)生活需求有重要意義。

多數(shù)谷子品種的小米為黃色，黃色的主要來(lái)源為黃色素。小米黃色素主要組分為天然類胡蘿卜素，主要含有葉黃素、玉米黃質(zhì)以及少量的隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素等[3-5]，這些類胡蘿類素不僅具有保護(hù)視覺(jué)與上皮細(xì)胞的作用，而且可以提高人體免疫力，淬滅體內(nèi)過(guò)多自由基，預(yù)防多種癌癥，同時(shí)對(duì)口腔潰瘍、皮膚病等都有很好的療效。不同谷子品種的小米黃色素及主要組分類胡蘿卜素含量存在差異，研究培育類胡蘿卜含量高，色澤金黃，外觀品質(zhì)好的谷子新品種是谷子遺傳育種的重要目標(biāo)之一，因此定量測(cè)定谷子品種小米黃色素含量對(duì)于選育高類胡蘿卜素含量的品種有重要的意義。同時(shí)，定量測(cè)定小米黃色素含量有助于小米產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)小米產(chǎn)品的精深加工。

小米黃色素具有一定的耐熱性、耐還原性和耐氧化性,對(duì)光和酸性條件穩(wěn)定性較差，不溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑,其乙醇提取物最大吸收波長(zhǎng)為445 nm或446 nm[6-8]；利用超聲波輔助提取可以明顯增加小米黃色素產(chǎn)量[9-10]。這些研究主要側(cè)重于對(duì)小米黃色素化學(xué)性質(zhì)及其提高小米黃色素得率，研究探討利用提取的小米黃色素作為色素添加劑應(yīng)用食品工業(yè)等方面，而關(guān)于小米黃色素的定量測(cè)定研究則較少。楊延兵等[12-13]參考美國(guó)谷物化學(xué)師協(xié)會(huì)AACC 14-50[11]測(cè)定小麥粉黃色素的方法研究了我國(guó)谷子品種小米黃色素含量的差異及小米黃色素與外觀品質(zhì)的關(guān)系,研究表明小米黃色素含量的高低不僅和小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有關(guān)，而且也是反映小米外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)。然而，小米黃色素組成和小麥粉黃色素組成可能存在一定的差異。因此，優(yōu)化完善谷子品種中小米黃色素的測(cè)定，比較準(zhǔn)確地測(cè)定小米黃色素含量，盡可能減少誤差，具有重要的意義。

本研究從不同溶劑、提取時(shí)間、提取方式和回收率等方面對(duì)小米黃色素的測(cè)定進(jìn)行了研究，以期為小米黃色素的定量測(cè)定以及谷子品質(zhì)育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

谷子品種：濟(jì)谷12、濟(jì)谷16、濟(jì)谷17、濟(jì)谷19、豫谷18。

標(biāo)準(zhǔn)品及試劑：葉黃素、玉米黃素、β-胡蘿卜素標(biāo)樣： Chromadex 公司；β-隱黃質(zhì)：Sigma公司(美國(guó))；三氯甲烷、無(wú)水乙醇、正丁醇等試劑：國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器設(shè)備

RETSCH粉碎機(jī)；SORVALL臺(tái)式多用離心機(jī)-冷凍型；UV2600紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 不同提取因素對(duì)小米黃色素的提取實(shí)驗(yàn)

不同溶劑提取小米黃色素：選用無(wú)水乙醇、水飽和正丁醇3種不同溶劑進(jìn)行提取。

不同提取方式提取小米黃色素：無(wú)水乙醇、水飽和正丁醇2種提取液振蕩提取(1、2、3 h)和振蕩提取(1、2、3 h)+超聲波提取20 min。

利用水飽和正丁醇提取不同時(shí)間的小米黃色素：1、3、5、7、24 h。

1.3.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 樣品處理測(cè)定

用礱谷機(jī)把谷子籽粒脫殼，把小米超離心粉碎。稱取1.00 g樣品放入約30 mL具塞的離心管內(nèi)，加入10.0 mL水飽和正丁醇，蓋緊塞子，混旋器上混合，使樣品充分濕潤(rùn)。把離心管放在往復(fù)振蕩機(jī)上避光振蕩提取一定時(shí)間，然后靜置10 min。10 000×g離心8 min至上清液清亮，以水飽和正丁醇空白作對(duì)照，吸收波長(zhǎng) 445 nm處測(cè)定提取液吸光度，計(jì)算黃色素含量。

小米黃色素含量=ε·A，ε為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的系數(shù)，A為提取液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)小米黃色素的影響

利用無(wú)水乙醇和水飽和正丁醇提取不同谷子品種小米黃色素，進(jìn)行光譜掃描，記錄最大峰值。無(wú)水乙醇和水飽和正丁醇提取同一品種小米黃色素掃描光譜有一定差異(圖1為濟(jì)谷19小米2種提取液掃描光譜)。2種溶劑提取的小米黃色素最大吸收峰值也略有差異(表1)，不同品種無(wú)水乙醇提取液最大波峰值平均為445.8 nm，水飽和正丁醇提取液最大波峰值平均為447.5 nm。說(shuō)明2種提取液提取的小米黃色素在質(zhì)和量上有一定差異。同一提取液不同品種之間最大吸收波長(zhǎng)也略有差異，這說(shuō)明不同品種之間在黃色素的組分上存在差異。

圖1 不同提取溶劑提取濟(jì)谷19小米黃色素吸收光譜圖

品種無(wú)水乙醇提取液/nm水飽和正丁醇提取液/nm濟(jì)谷12446.0447.6濟(jì)谷16446.0447.4濟(jì)谷17445.4447.4濟(jì)谷19446.0447.6豫谷18445.4447.3平均445.8447.5

圖2 小米黃色素及部分類胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光譜圖

2.2 小米黃色素與主要組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光譜比較

對(duì)小米黃色素提取物及葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在350～550 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描(圖2)。不同類胡蘿卜素之間光譜特征有一定差異，小米黃色素的光譜特征和葉黃素光譜特征最接近。葉黃素最大峰值445 nm，玉米黃質(zhì)最大峰值452 nm，β-隱黃質(zhì)最大峰值451 nm，β-胡蘿卜素最大峰值450 nm，小米黃色素最大峰值447.5 nm。

2.3 提取溶劑對(duì)小米黃色素含量提取效率的影響

分別利用水飽和正丁醇和無(wú)水乙醇往復(fù)震蕩提取3 h進(jìn)行提取完全度實(shí)驗(yàn)，測(cè)定5個(gè)谷子品種小米黃色素含量，結(jié)果如表2。每個(gè)品種無(wú)水乙醇提取液小米黃色素測(cè)定值都低于水飽和正丁醇提取小米黃色素測(cè)定值，乙醇提取小米黃色素測(cè)定值只有水飽和正丁醇提取測(cè)定值的66.93%～73.76%，平均為69.78%，利用水飽和正丁醇提取的小米黃色素較完全。

表2 不同提取溶劑對(duì)小米黃色素含量的影響

2.4 提取方式對(duì)小米黃色素含量的影響

以濟(jì)谷16小米樣品為試材，分別利用水飽和正丁醇和無(wú)水乙醇采用振蕩提取和振蕩提取+超聲波20 min 2種方式，提取不同時(shí)間(1、3、5 h)，測(cè)定小米黃色素含量，結(jié)果表3。同一提取時(shí)間，水飽和正丁醇提取黃色素含量顯著大于乙醇提取黃色素含量。2種溶劑同一時(shí)間振蕩提取后，再用超聲波提取20 min，黃色素含量平均值明顯增大，但標(biāo)準(zhǔn)偏差也相應(yīng)增大，測(cè)定黃色素含量的穩(wěn)定性變差。

表3 不同提取方式小米黃色素含量的影響/mg/kg

2.5 提取時(shí)間對(duì)小米黃色素含量的影響

利用水飽和正丁醇提取小米黃色素1、2、3、5、7、24 h，測(cè)定結(jié)果如表4。提取1 h黃色素含量略低，3～7 h小米黃色素含量基本維持在平臺(tái)期，黃色素含量的變化很小。因此，小米黃色素振蕩提取3 h后測(cè)定，在2～4 h時(shí)間內(nèi)測(cè)定完畢，小米黃色素含量變化相對(duì)較小。振蕩提取24 h后小米黃色素含量有略微下降，這可能與提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分小米黃色素降解所致。所以測(cè)定小米黃色素含量以先振蕩提取3 h，再開(kāi)始測(cè)定為宜。

表4 提取時(shí)間對(duì)小米黃色素含量的影響/mg/kg

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

繪制的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3，線性范圍0～5.0 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：小米黃色素含量=54.7·A，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 不同谷子品種黃色素樣品測(cè)定與回收率分析

精確稱取1.0 g不同谷子品種小米樣品，每個(gè)樣品重復(fù)5次，按照1.3.5制備的樣品溶液，振蕩提取3 h，測(cè)定小米黃色素含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。同時(shí)，每個(gè)樣品再稱取5份，添加β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表5。結(jié)果5個(gè)谷子品種相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 1.16%～2.14%，都小于3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，精密度較高。各樣品加標(biāo)回收率為92.77%～103.18%，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果及加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 討論

本研究分別利用無(wú)水乙醇和水飽和正丁醇提取小米黃色素，利用水飽和正丁醇提取小米黃色素較完全，得率較高。利用水飽和正丁醇提取小米黃色素，經(jīng)過(guò)高速離心后一般提取上清液透明，測(cè)定值較穩(wěn)定，比較適于對(duì)小米黃色素含量做定量測(cè)定。但正丁醇會(huì)易散發(fā)出令人難聞的氣味，測(cè)定最好在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。用無(wú)水乙醇提取，小米黃色素得率低于水飽和正丁醇提取；而且離心后，部分品種提取液易出現(xiàn)一定的渾濁，測(cè)定值不太穩(wěn)定，不太適用于大量樣品谷子黃色素的定量測(cè)定；但由于無(wú)水酒精提取液酒精易揮發(fā)，酒精揮發(fā)后得到黃色素固體粉末，且酒精無(wú)毒，適于食用色素的提取。

有關(guān)研究表明，利用超聲波提取，可以提高小米黃色素產(chǎn)量[9-10]，本研究表明超聲波的確能增加黃色素產(chǎn)量。但是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，超聲波提取后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性變差，有的提取液中有細(xì)微小顆粒，疑似提取液渾濁。造成這種現(xiàn)象的原因可能是超聲提取狀態(tài)下，產(chǎn)生細(xì)微的固體或液體顆粒，而這種小顆粒難以通過(guò)加大離心轉(zhuǎn)速解決，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大；因此定量測(cè)定小米黃色素，提取過(guò)程不宜使用超聲波處理，直接振蕩提取就可。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同提取時(shí)間、提取方式對(duì)小米黃色素含量的影響，提取時(shí)期短提取不充分，研究條件下認(rèn)為振蕩提取3 h是比較適宜的時(shí)間；3～5 h時(shí)間內(nèi)避光振蕩提取對(duì)小米黃色素變化較小，這為大批量測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品提供了參考。

本研究分別利用無(wú)水乙醇和水飽和正丁醇提取小米黃色素，無(wú)水乙醇提取液最大吸收波長(zhǎng)平均445.8 nm，水飽和正丁醇最大吸收波長(zhǎng)平均447.5 nm，與其他研究結(jié)果類似[7-8,15]。葉黃素為小米中黃色素最主要組分，本研究中小米葉黃素最大吸收峰波長(zhǎng)為445.8 nm，這和報(bào)道的葉黃素波長(zhǎng)基本相同[16]，細(xì)微的波長(zhǎng)差異可能在于物質(zhì)的純度及測(cè)定誤差。AACC 14-50測(cè)定小麥的黃色素含量測(cè)定波長(zhǎng)為435.8 nm，其主要根據(jù)混合物中主要組分葉黃素設(shè)定測(cè)定的吸收波長(zhǎng)[16]，本研究中小米黃色素的吸收光譜和葉黃素吸收光譜最相似，葉黃素的最大吸收波長(zhǎng)為445 nm, 所以本研究中黃色素含量都在445 nm下測(cè)定。研究利用β-胡蘿卜素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，而小米黃色素主要成分為葉黃素和玉米黃質(zhì)，β-胡蘿卜素含量較少[5]，小米黃色素為多種胡蘿卜素或類胡蘿卜素的混合物，所以測(cè)定的小米黃色素含量不是絕對(duì)含量，而是同一測(cè)定系統(tǒng)下的相對(duì)值。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)完善優(yōu)化了小米黃色素的提取測(cè)定方法，以水飽和正丁醇為提取液，避光振蕩提取3 h，10 000×g離心8 min，在445 nm下測(cè)定上清液吸光度，以β-胡蘿卜素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算小米黃色素含量。該方法靈敏準(zhǔn)確、精密度較高，能滿足小米黃色素測(cè)定的要求。