王曉玲 黃 鐘 鄧廣雪 何子凡 劉 冬 盧獻靈

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,石河子832000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見的以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，呼吸癥狀和氣流受限是由于氣道和/或肺泡異常導致的，氣道和/或肺泡異常的原因通常是明顯的有毒顆粒和氣體暴露[1]。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體是細胞胞漿內的一種大分子復合蛋白，是目前研究最為廣泛且最具代表性的炎性小體，由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1)三部分組成，參與調節(jié)機體的固有免疫反應[2]。本課題組前期研究結果表明：NLRP3-caspase-1-IL-1β/IL-18通路參與COPD患者的機體炎癥反應[3]。硫氧還蛋白結合蛋白(Thioredoxin interacting protein，TXNIP)又稱之為維生素D3上調蛋白1(Vitamin D3 upregulated protein 1,VDUP-1)硫氧還蛋白結合蛋白2(Thioredoxin-binding protein 2，TBP-2)，最初被發(fā)現(xiàn)在用1,25-二羥維生素D3治療的HL-60白血病細胞中[4]。最近的研究表明，TXNIP 參與了一些關鍵的氧化還原相關的信號通路，包括 NLRP3炎性小體激活中的依賴性氧化還原，即TXNIP/NLRP3炎性小體通路。但目前尚無關于TXNIP/NLRP3炎性小體通路在COPD患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)中表達研究的報道。

本文旨在研究TXNIP、NLRP3炎性小體在COPD患者和健康人之間表達的差異，探討TXNIP/NLRP3炎性小體通路在COPD發(fā)病機制中的可能作用，為COPD的治療提供新依據。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選擇2017年11月至2018年5月于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院住院的COPD急性加重期患者40例納入急性加重期組，其經抗感染、祛痰止咳、解痙對癥等處理，咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微，病情基本恢復到急性加重前的狀態(tài)，判斷為進入穩(wěn)定期，納入COPD穩(wěn)定期組。于我院體檢科選取 40 例同期健康體檢者納入對照組。COPD診斷標準參考中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組于2013年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》。排除標準：患者有支氣管哮喘、矽肺、肺結核、間質性肺疾病等慢性疾??；合并冠心病、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、肝腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的患者；納入前一月內使用過糖皮質激素的急性加重期慢阻肺患者；不能配合完成肺功能者。對照組為正常健康人群，依據隨機原則與病例組在性別、年齡上進行匹配。該研究通過石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有入選對象均簽署知情同意書。

1.1.2試劑與儀器 人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司，中國)；Trizol試劑(life-invitrogen公司，美國)；逆轉錄試劑盒(Thermo公司，美國)；熒光定量PCR試劑盒(Qiagen公司，德國)；TXNIP mRNA 、NLRP3 mRNA、β-actin mRNA引物(上海生工生物工程股份有限公司，中國);β-actin一抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)；TXNIP一抗(Abcam公司，美國)；NLRP3一抗(Cell Signaling Technology公司，美國)；化學發(fā)光底物(Thermo公司，美國)；紫外分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000，美國)；PCR儀(Thermo Hybaid 公司，美國)；Real-time PCR儀-7500Fast(Applied Biosystems,美國)；高速離心機(Thermo Scientific公司，美國)；WB電泳儀、WB轉膜儀；GEL-DOC2000凝膠圖像成像儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2方法

1.2.1記錄患者一般資料 采集各組患者清晨外周靜脈血6 ml，并對對照組和COPD患者急性加重期組進行肺功能檢查，記錄肺功能指標。

1.2.2Ficoll法分離PBMCs 用人外周血淋巴細胞分離液分離出外周血中的PBMCs，將PBMCs分成兩等份，一份加入1 ml Trizol試劑輕輕吹打混勻，-80℃凍存?zhèn)溆糜赗NA提取，一份直接-80℃凍存用于蛋白提取。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測PBMCs中TXNIP和NLRP3的mRNA表達 取出加有Trizol的PBMCs,嚴格按Trizol 試劑說明書操作提取總RNA，紫外分光光度計檢測并記錄總RNA的濃度與純度值，采用 260 nm/280 nm在1.8～2.0范圍者。cDNA的合成嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書操作。TXNIP上游引物：5′-AATTGGCAGCAGATCAGGTCTAAGC-3′，下游引物；5′-CATGTCATCTAGCAGAGGAGTGGTTG-3；NLRP3上游引物：5′-TGGCTGTAACATTCGGAGATTGTGG-3′，下游引物:5′-GCTTCTGGTTGCTGCTGAGGAC-3′；β-actin上游引物：5′-GCTGACAGGATGCAGAAGGA-3′，下游引物：5′-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′。根據熒光定量PCR試劑盒說明書，取1 μl逆轉錄獲得的 cDNA 建立 20 μl 的反應體系進行 PCR 擴增。反應條件為:95℃ 2 min(1個循環(huán))，95℃ 5 s，60℃ 30 s(40 個循環(huán))，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。由 2-ΔΔCt表示目的基因表達水平的高低。

1.2.4Western blot檢測PBMCs中TXNIP和NLRP3的蛋白表達 取出PBMCs，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清測定蛋白濃度并調平。加上樣緩沖液在100℃干浴鍋變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。根據Marker指示劑顯示蛋白充分分離后，將蛋白電轉移至硝酸纖維膜(PVDF膜)，置于含 5% 封閉液的平皿中，室溫搖床上搖動封閉2 h，β-actin一抗和TXNIP一抗分別用5%脫脂奶粉稀釋至1∶1 000，NLRP3一抗用5%胎牛血清(BSA)稀釋至1∶1 000，4℃ 過夜，次日TBST洗膜，加入相應的二抗(1∶10 000)室溫孵育 2 h，TBST 洗膜后與化學發(fā)光底物反應 1 min，置于X線膠片暗盒中曝光、顯影、定影，GEL-DOC2000凝膠圖像成像儀成像，用Image J 1.37c 軟件測定蛋白條帶的光密度并進行定量分析。

2 結果

2.1各組一般資料的比較 對照組與COPD組的性別、年齡、BMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，COPD組FEV1%pred和FEV1/FVC顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA表達量的比較 COPD患者急性加重期組的 TXNIP mRNA水平顯著高于穩(wěn)定期組(P<0.05)和對照組(P<0.05)。 急性加重期組NLRP3 mRNA水平顯著高于穩(wěn)定期組(P<0.05)和對照組(P<0.05)，穩(wěn)定期組NLRP3 mRNA 的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表1 對照組與COPD組患者的一般資料比較

Note：1)P<0.05 vs control group.

表2 各組TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA表達水平的比較

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs stable period group.AECOPD.Acute exacerbation of COPD.

2.3各組TXNIP 、NLRP3蛋白表達水平的比較 COPD患者急性加重期組的 TXNIP蛋白表達水平顯著高于穩(wěn)定期組(P<0.05)和對照組(P<0.05)。急性加重期組NLRP3蛋白表達水平顯著高于穩(wěn)定期組(P<0.05)和對照組(P<0.05)，穩(wěn)定期組NLRP3蛋白的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1、2。

2.4相關性研究 COPD患者急性加重期組TXNIP mRNA 表達量和穩(wěn)定期組TXNIP mRNA表達量均與CAT評分正相關(r=0.331,P=0.037；r=0.361,P=0.022) ；急性加重期組NLRP3 mRNA表達量與FEV1%pred、 FEV1/FVC負相關(r=-0.334,P=0.035；r=-0.347,P=0.028)；急性加重期組NLRP3 mRNA表達量和穩(wěn)定期組NLRP3 mRNA 表達量均與CAT評分正相關(r=0.337,P=0.034；r=0.423,P=0.007)。結果見表3、4。

圖1 Western blot 檢測各組外周血單個核細胞中TXNIP蛋白的表達量Fig.1 Expression of TXNIP protein in PBMCs detected by Western blotNote: 1.Control group；2.AECOPD group；3.Stable period group.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs stable period group.

圖2 Western blot 檢測各組NLRP3蛋白的表達量Fig.2 Expression of NLRP3 protein in PBMCs detected by Western blotNote: 1.Control group;2.AECOPD group;3.Stable period group.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs stable period group.

表3 各組TXNIP mRNA與臨床指標的相關性分析

表4 各組NLRP3 mRNA與臨床指標的相關性分析

3 討論

COPD是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病，然而其確切的發(fā)病機制尚不明確。氧化應激作為COPD最主要的發(fā)病機制，能增強炎癥、激活關鍵抗蛋白酶抑制劑、增加肺泡細胞的凋亡，成為目前研究的熱點[5]。吸煙是引起COPD的主要危險因素之一，香煙煙霧中含有大量的氧化劑和自由基，吸入體內后可導致氧化/抗氧化失衡，即體內的氧化劑如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產生過多而機體的抗氧化能力下降，導致氧化應激的發(fā)生。

本課題組的前期研究表明NLRP3-caspase-1-IL-1β/IL-18通路參與COPD患者的機體炎癥反應[3]。線粒體ROS的生成作為NLRP3炎性小體主要的激活途徑之一，當細胞發(fā)生氧化應激，產生的 ROS促進與硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)相互作用的硫氧還蛋白結合蛋白(Thioredoxin interacting protein，TXNIP)與細胞中的TRX相互解離，并使之與NLRP3結合，從而激活NLRP3炎性小體[6]。目前針對TXNIP/NLRP3炎性小體通路的研究大部分集中于糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病[7-9]，尚無關于TXNIP/NLRP3炎性小體通路在COPD患者PBMCs中表達研究的報道。深入了解TXNIP/NLRP3炎性小體通路在COPD患者中的作用表達，有助于進一步認識COPD形成及發(fā)展，同時為其他研究者探究抑制TXNIP的治療藥物提供一定依據。

本研究發(fā)現(xiàn)COPD患者急性加重期組PBMCs中TXNIP mRNA表達水平高于對照組，且急性加重期顯著高于穩(wěn)定期。張丹等[10]發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠支氣管組織中TXNIP mRNA顯著高于對照組和穩(wěn)定期組，認為TXNIP的升高可能與其調節(jié)氣道炎癥中重要炎癥因子的作用有關。本研究中發(fā)現(xiàn)COPD患者急性加重期組PBMCs中TXNIP蛋白表達水平顯著高于對照組和穩(wěn)定期。Colarusso等[11]也認為炎癥激活劑誘導TXNIP參與香煙煙霧引起的COPD氧化應激反應。這表明COPD患者機體受到炎癥信號刺激后，PBMCs中的TXNIP分子通過增加TXNIP mRNA和蛋白的表達量來參與COPD患者急性加重期的機體炎癥反應。急性加重期組患者通過臨床藥物，如糖皮質激素類藥物的有效治療，隨著機體炎癥反應的減弱，致使TXNIP在基因水平和蛋白水平表達量下降。

本研究中急性加重期組和穩(wěn)定期組COPD患者PBMCs中NLRP3 mRNA 水平均顯著高于對照組，且急性加重期組顯著高于穩(wěn)定期組。該結果與本課題組前期研究測定COPD患者PBMCs中NLRP3 mRNA表達水平相一致。本研究進一步通過Western blot技術分別測三組PBMCs中NLRP3蛋白的表達水平并進行比較，發(fā)現(xiàn)其表達趨勢與NLRP3 mRNA的表達趨勢一致。Peng等[12]在動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，COPD組大鼠肺組織中NLRP3 蛋白表達較對照組顯著增高，且治療后顯著降低。這進一步表明COPD患者PBMCs中NLRP3炎性小體活化不僅受基因水平的調控，同時在蛋白水平受到進一步調控。COPD患者急性加重期組給予抗感染、祛痰止咳、解痙對癥等處理，其咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀穩(wěn)定或癥狀輕微，病情進入穩(wěn)定期，NLRP3 mRNA和蛋白表達隨之均降低，這證實了NLRP3炎性小體參與COPD患者急性加重期和穩(wěn)定期的機體炎癥反應。Hosseinian等[13]在炎性小體與COPD的作用機制中提到，ROS導致TRX-TXNIP復合物的分離，TXNIP綁定NLRP3，導致NLRP3、ASC和Pro-caspase 1的寡聚化，激活支氣管組織中NLRP3炎性小體。Jiang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷小鼠肺組織中TXNIP mRNA及蛋白、NLRP3 mRNA及蛋白表達水平較對照組均增高，經治療后其表達水平均顯著降低。這與本研究中發(fā)現(xiàn)的TXNIP和NLRP3表達水平相一致。這些研究結果均提示，氧化還原依賴NLRP3 炎性小體的調節(jié)可能是由于TXNIP/NLRP3炎性小體通路直接作用的結果。

肺功能指標是COPD嚴重程度分級的標準，本研究發(fā)現(xiàn)COPD患者急性加重期組NLRP3 mRNA 表達量與FEV1%pred 、FEV1/FVC呈負相關。這與很多研究結果相一致，王師等[15]和宋珊等[16]研究發(fā)現(xiàn)COPD患者外周血NLRP3炎性小體成分及下游分子mRNA 表達水平均與肺功能指標呈負相關。這表明NLRP3分子與COPD的嚴重程度有相關性，隨著病情的加重，NLRP3 mRNA的表達水平也隨之增加。CAT評分可以評估患者咳嗽、咳痰、胸悶、睡眠、精力、情緒和活動能力，有助于了解患者病情的進展情況。本研究中急性加重期組和穩(wěn)定期組NLRP3 mRNA 、TXNIP mRNA表達量均與CAT評分正相關，這提示NLRP3 mRNA 、TXNIP mRNA水平的變化可以反映COPD患者的病情嚴重程度和健康狀況，為臨床醫(yī)生了解COPD患者病情進展提供參考依據。另外，本研究中未發(fā)現(xiàn)TXNIP mRNA 與NLRP3 mRNA表達量的直接相關性，這可能與Zhou等[17]認為的氧化應激條件下增加TXNIP與NLRP3的相互作用，以TXNIP-NLRP3復合物的形式參與機體的炎癥反應有關。徐興婷等[18]研究認為白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比水平與COPD患者病情嚴重程度密切相關，但本研究中未發(fā)現(xiàn)其與NLRP3 mRNA 、TXNIP mRNA的相關性，臨床指標與機體炎癥分子間的相互作用關系較為復雜，有待進一步研究。

綜上所述，TXNIP/NLRP3炎性小體通路參與COPD患者的機體炎癥反應。本研究是首次在COPD領域PBMCs水平研究TXNIP表達，該研究提示TXNIP通過氧化還原失衡和NLRP3炎性小體激活參與COPD的發(fā)生發(fā)展，TXNIP、NLRP3的抑制可能為治療干預COPD提供新的靶點。