凌夏君 許 姣 李獻文 周燕娟 莊志方

(常州市武進人民醫(yī)院，江蘇大學附屬武進醫(yī)院呼吸內(nèi)科，常州213017)

人類99%的疾病均與機體免疫有關。免疫平衡系統(tǒng)是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理功能。在高度和諧的生理代謝中，機體的自穩(wěn)功能能夠及時準確地清除體內(nèi)損傷、衰老、變異的細胞和抗原性物質(zhì)——即抗體復合物等抗原異物，而對自身則保持高度的免疫耐受功能。免疫平衡是一個動態(tài)的平衡，只有處在相對的穩(wěn)定平衡狀態(tài)機體才是健康的，而免疫的失衡尤其是Th1/Th2的平衡一旦被打破，引起異常的免疫應答，機體將會出現(xiàn)病理狀態(tài)。本文將進一步解釋NSCLC過程中Th1/Th2失衡現(xiàn)象。

1 資料與方法

1.1材料 2014年1月～2015年10月期間在本院就診經(jīng)術后病理組織學檢查確診為NSCLC的患者45例為研究對象(肺癌組)。其中男25例，女20例，腺癌25例，鱗癌20例，年齡45～70歲。選擇癌旁正常肺組織標本(距離癌組織至少10 cm)作為對照(正常肺組織組)。

1.2方法

1.2.1HE、IHC檢測炎癥細胞及ST2表達 操作如下：①取材與固定：手術后取部分新鮮組織標本，用 10%福爾馬林固定48 h，進行石蠟包埋切片。②HE染色：二甲苯脫臘→乙醇脫水→蘇木精染色→水洗→伊紅染色→二甲苯→中性樹膠封片。③IHC：石蠟包埋的4 μm組織切片→酒精脫水、二甲苯脫蠟→緩沖液中修復→10%BSA封閉抗原→滴加大鼠抗人ST2單克隆抗體室溫孵育，陰性對照區(qū)域用PBS→滴加HRP標記的二抗室溫孵育→DAB 顯色，樹膠封固，鏡檢(每張切片放大100倍,棕黃色顆粒為陽性表達細胞，陽性表達細胞計數(shù)法：40×10光鏡下,隨機10個視野下計數(shù)陽性著色細胞。 依據(jù)陽性細胞數(shù)量分為弱陽性(陽性細胞數(shù)在25%以下);中等陽性(陽性細胞數(shù)在25%～49%);強陽性(陽性細胞數(shù)在50%以上)。

1.2.2RT-PCR檢測NSCLC癌組織及正常肺組織中ST2、IL-4、IFN-γ的表達 2014年1月～2015年10月期間在本院就診經(jīng)病理組織學、細胞學檢查確診為肺癌的45例患者，手術后取部分新鮮組織標本冷凍于液氮中。Trizol試劑一步法提取總RNA，計算RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR反應：反應體系為25 μl，反應條件為:95℃預變性3 min，然后循環(huán)40次(95℃變性15 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s)，溶解條件:95℃ 15 s、60℃ 15 s、95℃ 15 s。引物的設計采用Primer5，目的基因引物及產(chǎn)物大小見表1。

2 結(jié)果

2.1NSCLC癌組織周圍炎癥細胞浸潤及ST2表達 HE染色顯示細胞大而圓，核為深藍紫色淋巴細胞(炎癥細胞)浸潤肺鱗癌、肺腺癌組織，IHC顯示炎性細胞弱陽性表達ST2，而距離癌組織10 cm以上的正常組織中炎癥細胞較少，基本不表達ST2(見圖1、2)。

表1 目的基因引物及產(chǎn)物大小

2.2NSCLC癌組織 ST2 mRNA 的表達 NSCLC癌組織高表達ST2 mRNA，與正常肺組織相比，有統(tǒng)計學意義(圖3，P<0.01)。

2.3NSCLC肺癌組織中IL-4、IFN-γ mRNA的表達 NSCLC肺癌組織中IL-4的表達占優(yōu)勢，IL-4/IFN-γ>1，與正常肺組織組比較，差異有統(tǒng)計學意義(表2，P<0.01)。

圖1 NSCLC癌組織周圍炎癥細胞浸潤(HE，×100)Fig.1 Inflammatory cell infiltration around NSCLC tissue(HE，×100)

圖2 NSCLC癌組織中ST2表達(IHC，×100)Fig.2 ST2 in tumor tissues of NSCLC(IHC，×100)

圖3 NSCLC患者肺癌組織ST2的表達Fig.3 ST2 mRNA in tumor tissues of NSCLC

表2 NSCLC肺癌組織中IL-4、IFN-γ的表達

3 討論

免疫平衡系統(tǒng)是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種動態(tài)平衡，只有處在相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)機體才是健康的。機體免疫系統(tǒng)通過細胞免疫機制能識別并特異地殺傷突變細胞，在形成腫瘤前清除機體每天的突變細胞，即免疫監(jiān)視功能(Immune monitoring function)。然而，部分腫瘤細胞發(fā)生了免疫逃逸，發(fā)展為進展性腫瘤。天然免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞等，適應性免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞以及內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等組成的間質(zhì)組織、腫瘤細胞本身共同組成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的多種細胞通過直接或間接方式相互作用促進或抑制腫瘤細胞的生長[1，2]。其中機體免疫系統(tǒng)通過細胞免疫機制能識別并特異地殺傷突變細胞，在形成腫瘤前清除機體每天的突變細胞，即免疫監(jiān)視功能。然而，部分腫瘤細胞發(fā)生了免疫逃逸，發(fā)展為進展性腫瘤。因此，只有處在相對穩(wěn)定免疫平衡狀態(tài)機體才是健康的。本實驗通過HE染色證明肺鱗癌及腺癌組織中浸潤了淋巴細胞為主的免疫細胞，而癌旁正常肺組織較少浸潤免疫細胞。我們用Th1和Th2細胞分泌的特異因子IFN-γ和IL-4分別代表Th1和Th2細胞的活化情況。本文RT-PCR結(jié)果提示NSCLC癌旁正常肺組織中IFN-γ相對表達量較高，而IL-4表達相對較少(IL-4/IFN-γ<1)，即肺癌組織中存在Th1優(yōu)勢，NSCLC肺癌組織中IL-4表達量相對較多(IL-4/IFN-γ>1)，即出現(xiàn)了Th1/Th2偏移現(xiàn)象。Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-β等為主的細胞因子，促進巨噬細胞活化和CTLS(細胞毒T淋巴細胞)分化，主要參與細胞免疫反應和吞噬依賴性的保護反應。相反，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子，抑制巨噬細胞的功能，促進B細胞的生長和分化，參與抗體的大量產(chǎn)生，引起吞噬非依賴性保護反應。Ostrand-Rosenberg S指出特異性免疫和非特異性免疫具有“雙刃劍”作用即抑制或促進腫瘤形成。1型CD4+T可輔助CD8+T 抑制腫瘤的形成及發(fā)展，而2型CD4+T通過B細胞主導的體液免疫過程使機體發(fā)生免疫傾斜，促進腫瘤的發(fā)展。腫瘤相關性巨噬細胞(TAMS)即M2巨噬細胞是腫瘤間質(zhì)的重要組成，對腫瘤血管形成及基質(zhì)形成起著重要作用，而M1巨噬細胞通過產(chǎn)生Th1細胞因子或作為抗原提呈細胞將抗原提呈給CD8+T 發(fā)揮抑制腫瘤的作用[3,4]。Th2 CD4+T細胞通過誘導TAMS產(chǎn)生促血管形成和促轉(zhuǎn)移因子，促進乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，CD4+/CD8+和Th2/Th1高比例預示著乳腺癌預后較差[5,6]。ST2又名T1、Fit-1、DER4，為Toll樣-白介素1受體家族(TIRs)成員[7-9]。Yanagisawa等[10]證明ST2基因主要表達于Th2細胞[11-13],Le′cart等[14]發(fā)現(xiàn)激活的Th2細胞表達可溶性ST2，低表達ST2L。本實驗證明，與癌旁正常肺癌組織相比，非小細胞肺癌組織高表達ST2的同時也高表達IL-4，提示癌組織存在Th2型因子的強勢表達狀態(tài)。

綜上所述，吸煙、環(huán)境污染等誘因通過損傷相關分子模式(DAMP)或者直接激活了Th2反應的“開關”ST2，開啟Th2免疫反應參與非小細胞肺癌形成與發(fā)展過程。通過Th2免疫反應參與了非小細胞肺癌形成與發(fā)展過程，提示如果能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中促使腫瘤細胞或患者機體的免疫細胞由Th2向Th1型逆轉(zhuǎn)，將為腫瘤的免疫治療提供新的方向。ST2有可溶性ST2和模型ST2L兩種形式，其生物作用尚不甚明確，因此，有關蛋白ST2的作用研究有待進一步展開。本實驗進組例數(shù)較少，仍需大樣本實驗進一步證實。