張忠寶 孫禮進 曾 波 陳詠梅 張 智 李再新

(四川理工學院，自貢643000)

變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)簡稱變鏈菌，是引起齲病的主要致病菌之一，具有較高的傳染性，在口腔中其檢出率高達74%～94%，嚴重危害人類牙齒健康[1]。其致齲機理在于S.mutans能黏附于牙面，形成產(chǎn)酸的生物膜，致使牙釉質(zhì)層脫礦，導致齲齒。隨著分子生物學手段的發(fā)展，人們對S.mutans的認識不斷深入，其主要的毒力因子SpaP、Gtfs和Gbps已成為目前研究的熱點。其中葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferases，Gtfs)由gtfS基因編碼，有1 400～1 600個氨基酸，能夠合成水溶性及水不溶性葡聚糖，CAT區(qū)域是其N端1/3處的功能區(qū)域，位于第442～464位氨基酸，是Gtfs的催化活性區(qū)，包含B淋巴細胞識別的抗原決定簇[2-4]。而葡聚糖結合蛋白(Glucan-binding proteins，Gbps)由gbpB基因編碼，是一類具有結合葡聚糖活性(α-1,6糖苷鍵葡聚糖結合)的表面黏附蛋白，其中的GbpB具有431個氨基酸，N端1/3處為高免疫原性區(qū)域，功能區(qū)域SYI位于第113～132位氨基酸，具有T淋巴細胞的MHCⅡ抗原提呈識別作用，并且GbpB組合Gtfs的嵌和多肽片段比單獨使用GbpB具有更高的抗體效價[5,6]。這些毒力因子是造成齲齒的關鍵所在，利用化學藥物、天然藥物和抗菌肽等藥物治療齲病是目前常用的方法，然而抗生素藥物的濫用會使S.mutans產(chǎn)生耐藥性。因此，研發(fā)安全、高效的抗菌制劑來治療齲齒尤為迫切。

卵黃抗體(IgY)是指將抗原免疫禽類后，從卵細胞中能大量獲得的特異性抗體[7,8]。該抗體生產(chǎn)工藝簡單、經(jīng)濟安全且穩(wěn)定性好，已經(jīng)在疾病診斷和治療方面有廣泛的應用，所以利用基因工程技術研制抗變形鏈球菌的特異性卵黃抗體具有重要意義。本實驗對S.mutans毒力因子Gtfs和GbpB的功能區(qū)進行串聯(lián)表達并制備融合蛋白IgY進行評估，為深入研究S.mutans表面毒力蛋白的功能及建立IgY預防和控制齲齒病的免疫方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與載體 S.mutans菌種由本實驗鑒定分離保存，大腸桿菌BL21、Top10和原核表達載體pET-32a均由本實驗保存。

1.1.2主要試劑 蛋白胨-酵母-半胱氨酸-蔗糖-桿菌肽培養(yǎng)基(Tryptone yeast cystine sucrose bacitracin medium，TYCSB)按照Gold等方法配制[9]；牛心腦浸液培養(yǎng)基(Brain heart infusion，BHI)購自青島日水生物技術有限公司；Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF、XhoⅠ、T4 DNA Ligase購自NEB公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的兔抗雞IgY購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1菌種培養(yǎng)與基因組提取 將凍存的S.mutans菌種復蘇后涂布于TYCSB培養(yǎng)基，用封口膜密封培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于37℃微需氧環(huán)境(5%O2，10%CO2，85%N2)。2 d后挑取單個菌落接種于含BHI培養(yǎng)基(蔗糖含量為5%)的試管中進行擴大培養(yǎng)，待觀察到貼壁菌落時收集菌體，用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取S.mutans基因組。

1.2.2引物設計與合成 從GenBank上調(diào)取S.mutans標準菌株UA159(AE014133.2)的基因組序列，利用在線軟件BepiPred 1.0 Server預測抗原蛋白表位并結合文獻[10]選取目的基因的功能區(qū)，使用Primer Premier 5.0軟件設計針對gtfS的CAT區(qū)域序列和gbpB的SYI區(qū)域序列的特異性引物，并由華大基因合成。引物序列見表1。

1.2.3基因片段的TD-PCR擴增 以提取的S.mutans基因組作為DNA模板，使用引物CAT-F和CAT-linker-R擴增gtfS的CAT區(qū)域片段，使用引物SYI-linker-F和SYI-R擴增gbpB的SYI區(qū)域片段。PCR反應體系如下：dNTP mix 5 μl，10×buffer 5 μl，50 ng/μl的DNA 1 μl，20 μmol/L的上下游引物各0.5 μl，Pfu DNA聚合酶0.5 μl，加水至50 μl。根據(jù)參考文獻[11]，TD-PCR反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性1 min，65℃退火40 s每次下降1℃直至55℃，72 ℃延伸100 s；65℃至56℃每個溫度上進行4個循環(huán)，最后55℃循環(huán)30次，72℃終延伸5 min。PCR反應結束后，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并用膠回收試劑盒純化回收目的片段。

1.2.4串聯(lián)基因CAT-SYI的SOE-PCR擴增 使用紫外分光光度計測定回收產(chǎn)物濃度，按照1∶1等量混合作為DNA模板，使用引物CAT-F和SYI-R進行擴增。PCR反應體系如下：dNTP mix 5 μl，10×buffer 5 μl，混合模板1 μl，Pfu DNA聚合酶0.5 μl，加水至50 μl。根據(jù)參考文獻[12]，SOE-PCR反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性1 min，65℃退火40 s，72℃延伸100 s；一個循環(huán)后加入 20 μmol/L 的上下游引物各0.5 μl，以相同條件繼續(xù)進行30個循環(huán)。反應結束后，對產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測并回收目的片段。

表1 特異性引物序列

Note：The underline part is the enzyme cutting site and the thickening part is the introduction of the flexible amino acid sequence.

1.2.5重組質(zhì)粒的構建與鑒定 使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF和XhoⅠ分別對串聯(lián)基因CAT-SYI和pET-32a載體進行酶切反應并回收目的片段。使用T4 DNA連接酶進行連接，于16℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，涂布于含1/1 000氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落進行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送至華大基因測序。

1.2.6重組菌的誘導表達及鑒定 將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，涂布于含1/1 000 氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落接種于5 ml含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，以37℃、200 r/min培養(yǎng)4～6 h，當菌液OD600值=0.6時，加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，以30℃、150 r/min培養(yǎng)6～8 h。收集菌體后，4℃、5 000 r/min離心1 min，用PBS溶液洗滌2次，向菌體沉淀中加入20 μl去離子水和20 μl變性buffer，混勻后沸水浴5 min，冰浴5 min，4℃、12 000 r/min離心2 min后取上清液進行SDS-PAGE鑒定。

1.2.7重組融合蛋白的純化 對重組融合蛋白進行可溶性分析后，將超聲破碎后的沉淀菌體用含0.1% Triton 和2 mol/L尿素的PBS溶液重懸，4℃ 10 000 r/min離心10 min。收集沉淀，用含2 mol/L尿素的PBS溶液重懸，離心棄上清。包涵體沉淀用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液攪拌20 min，溶解后4℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清，移入處理好的透析袋內(nèi)，置4℃進行梯度透析復性[13]。復性結束后用含5%甘油的PBS溶液置換Tris緩沖液透析4 h，最后轉(zhuǎn)入含5%甘油的超純水中透析過夜。透析后的蛋白液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清并用冷凍干燥機濃縮，對濃縮后的純化蛋白進行SDS-PAGE。

1.2.8融合蛋白IgY的制備 將純化的重組融合蛋白抗原與等體積完全弗氏佐劑混勻充分乳化后，采用胸肌三點肌肉注射免疫產(chǎn)蛋雞，劑量為0.5 ml/只，此后免疫佐劑改為不完全弗氏佐劑，每2周免疫1次，一共免疫3次。第3次免疫1周后收集雞蛋，利用聚乙二醇(PEG)沉淀法從雞蛋黃中提取IgY，并用SDS-PAGE檢測IgY的純度[14]。

1.2.9融合蛋白IgY的ELISA檢測 采用0.05 mmol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組融合蛋白濃度稀釋為10 μg/ml，按每孔100 μl加入到酶標板孔內(nèi)進行包被，于4℃靜置過夜。使用PBST緩沖液洗滌3次，每次3 min，每孔加入200 μl含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液，于37℃恒溫箱中封閉1.5 h。用PBST緩沖液洗滌3次，用含1%脫脂奶粉的PBST緩沖液將融合蛋白IgY按照1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶50 000、1∶100 000共6個稀釋比例進行稀釋，每孔加入100 μl，室溫孵育2 h。PBST洗滌3次后，加入1∶30 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗雞酶標抗體，每孔100 μl，于37℃恒溫箱中靜置30 min。PBST洗滌3次后每孔加入100 μl的TMB底物溶液，室溫避光顯色 5～10 min。待顏色有明顯變化時每孔加入100 μl 1 mol/ml的H2SO4終止反應，酶標自動分析儀于450 nm波長處測定其光吸收值(OD450)。設置陰性對照(非S.mutans抗原)與PBS空白對照，當P/N值>2.1時，判定為陽性結果[15]。

1.2.10融合蛋白IgY的Western blot 鑒定 分別將純化的S.mutans毒力蛋白Gtfs和GbpB進行SDS-PAGE電泳，結束后取出凝膠，分別經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至甲醇活化的PVDF膜(電轉(zhuǎn)條件：20 V，1 h)。取出膜用PBS洗滌，然后加入融合蛋白IgY于37℃作用1.5 h，以免疫前提取的IgY作為對照，用PBS洗滌后加入HRP標記的羊抗雞二抗作用1 h。將PVDF膜浸泡于現(xiàn)配的DAB顯色液中黑暗處理10～15 min，用去離子水終止反應并觀察顯色情況。

1.2.11斑點雜交 將甲醛滅活的S.mutans用0.05 mmol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液依次按照1∶10、1∶100、1∶500、1∶1 000共4個稀釋比例進行稀釋，點樣2 μl于甲醇活化的PVDF膜上，置37℃恒溫箱2 h。將膜用PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液，于搖床上室溫封閉2 h。PBST緩沖液洗滌3次后，加入用含1%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋至濃度為0.005 mg/ml 的一抗(純化的IgY)，4 ℃下放置過夜。PBST緩沖液洗滌3次后浸泡于按1∶3 000稀釋的二抗中，室溫反應1.5 h。PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入現(xiàn)配好的DAB液避光顯色1 min，用去離子水終止反應并觀察顯色情況。以對照組(非免疫)提取的IgY作為陰性對照。

2 結果

2.1目的基因的PCR擴增 經(jīng)過TD-PCR擴增，成功獲得了長度約為350 bp的gtfS功能區(qū)CAT的基因片段和長度約為400 bp的gbpB功能區(qū)SYI的基因片段，與預期目的片段大小相符(圖1A)。將兩段基因等量混合后作為模板，經(jīng)過SOE-PCR成功擴增出gtfS和gbpB的串聯(lián)基因CAT-SYI，大小約為750 bp，與預期目的片段大小相符(圖1B)。

2.2重組菌的誘導表達 將誘導前后的重組菌BL21-pET32a-CAT-SYI的菌體處理后進行SDS-PAGE，結果顯示誘導前后的重組融合蛋白均有一條非常明顯的蛋白條帶，大小約50 kD(圖2A)，與預期蛋白大小相一致，經(jīng)IPTG誘導后重組菌的蛋白表達量明顯增多。

2.3重組融合蛋白的純化 對重組融合蛋白進行可溶性分析后，得知重組菌在沉淀中的表達量較大，說明重組融合蛋白在E.coli BL21細胞中主要以包涵體形式表達。將重組融合蛋白以包涵體形式進行尿素梯度復性純化，純化后的重組融合蛋白在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)為單一蛋白條帶，分子量大小約50 kD(圖2B)，與預期蛋白大小一致，且純度大于90%。

2.4融合蛋白IgY的SDS-PAGE鑒定結果 將融合蛋白IgY用變性buffer處理后，進行SDS-PAGE，結果顯示有兩條明顯的蛋白條帶，與蛋白Marker對比，在分子量20～25 kD間為一條輕鏈，在分子量60～70 kD間為一條重鏈(圖3A)。IgY的純度在90%左右。

圖1 PCR擴增DNA片段核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis diagram of DNA fragment amplified by PCRNote: A.M.Marker;1.CAT-linker;2.SYI-linker;B.M.Marker;1.CAT-SYI.

2.5融合蛋白IgY的效價 利用ELISA間接法對融合蛋白IgY進行檢測，將酶標儀讀取的OD450值(除去空白OD450值的數(shù)值)繪制成折線圖(圖3B)。由圖分析，隨著抗體稀釋比例增加，OD450值逐漸減小，當融合蛋白IgY稀釋至最大倍數(shù)100 000倍時，P/N值>2.1，判定為陽性結果，表明融合蛋白IgY與重組融合蛋白能發(fā)生免疫反應，且其效價可達1∶100 000 以上。

2.6融合蛋白IgY的特異性 對融合蛋白IgY進行Western blot鑒定后，分別在相對分子量約為35 kD 和70 kD處出現(xiàn)相應的條帶，與預期的蛋白大小一致(圖4)，表明融合蛋白IgY能同時與毒力蛋白Gtfs和GbpB發(fā)生反應，而對照組沒有出現(xiàn)條帶。

圖2 重組融合蛋白及其純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Recombinant fusion protein and purified SDS-PAGENote: A.M.Marker;1.Preinduced recombinant fusion protein;2.Recombinant fusion protein after induction；B.M.Marker;1.Purified recombinant fusion protein.

圖3 融合蛋白IgY的SDS-PAGE電泳圖及其ELISA檢測結果Fig.3 SDS-PAGE of specific IgY and results of ELISA detectionNote: A.M.Marker;1.Specific IgY.

圖4 融合蛋白IgY的Western blot鑒定Fig.4 Western blot of IgYNote: M.Marker;1.Immuned IgY responsed with GbpB;2.Non-Immuned IgY responsed with GbpB;3.Immuned IgY responsed with Gtfs;4.Non-Immuned IgY responsed with Gtfs.

圖5 斑點雜交Fig.5 Dot-blotting

2.7斑點雜交結果 將融合蛋白IgY和陰性對照組IgY分別與S.mutans進行斑點雜交后，結果顯示，當抗原稀釋比為1∶10時，融合蛋白IgY可與S.mutans發(fā)生紅棕色顯色反應，陰性對照組未有顯色反應；當抗原稀釋倍數(shù)增大到1∶1 000時，融合蛋白IgY依然能識別S.mutans，而陰性對照組未有變化(圖5)，說明融合蛋白IgY與S.mutans能特異性相結合。

3 討論

齲病是一種由微生物引起的傳染性疾病，全球有60%～90%的青少年受其影響，而S.mutans被認為是引起齲病的主要病原菌之一，其黏附于牙齒表面，形成一層生物膜并集聚、增殖，利用外源性多糖產(chǎn)酸、耐酸，使牙齒發(fā)生一系列復雜的損壞[16]。其中生物膜的形成與S.mutans的表面蛋白密切相關，主要由PAc、Gtfs和Gbps等毒力蛋白介導。近年來針對S.mutans的主要毒力因子抗原表位和特定功能區(qū)的免疫防齲的研究已成為熱點。Robinette等[17]通過大腸桿菌原核表達PAc的A區(qū)包含唾液蛋白結合區(qū)(Saliva-binding region，SBR)，制備抗原免疫大鼠，激起了大鼠體內(nèi)T細胞的免疫應答，并產(chǎn)生了特異性抗體，在動物體內(nèi)獲得了免疫抑齲的保護作用。Nogueira等[18]通過黏膜免疫SD大鼠GtfB的CAT和GLU片段，激起了黏膜免疫應答并產(chǎn)生了特異性IgA抗體，獲得了免疫抑齲的效果。Huang等[19]將PAc基因(A區(qū)和P區(qū))與gtfB基因的GLU功能區(qū)串聯(lián)，構建真核質(zhì)粒，并制備DNA疫苗PGJA-P/VAX，免疫Wistar大鼠，成功激起大鼠體內(nèi)黏膜免疫應答，并產(chǎn)生特異性IgA，抑制了S.mutans的黏附作用?？梢娎肧.mutans毒力因子的功能區(qū)作用來免疫防齲取得了很好的效果，然而將功能區(qū)串聯(lián)起來免疫防齲的研究報道目前尚少，因此對于此方面的研究具有重要意義。

當前，用于治療齲齒病的方法有很多，而免疫防齲是如今研究的熱點，它包括“主動免疫防齲”和“被動免疫防齲”兩方面。“主動免疫防齲”是指將滅活S.mutans、表面抗原蛋白、多肽片段、DNA等制成可以使機體產(chǎn)生特異性免疫反應的生物制品，從而使機體獲得免疫保護，但主動免疫存在引起交叉免疫反應、破壞人體內(nèi)正常菌群生長的缺點[20]；“被動免疫防齲”是指通過向牛或雞注射抗原，從牛奶、蛋黃中獲得特異性抗體，再將抗體直接用于齲病治療的一種新途徑。本實驗就是采用重組融合蛋白免疫產(chǎn)蛋雞的方式來獲得多克隆卵黃抗體(IgY)的，IgY的純化工藝簡單、成本低，并且IgY具有哺乳動物IgG相同的中和抗原的功能，具有較高的應用價值。

本實驗利用PCR技術克隆了S.mutans的gtfS、gbpB基因的功能區(qū)域，通過SOE-PCR將gtfS和gbpB的DNA片段由一段柔性多肽鏈相連，成功獲得了串聯(lián)基因CAT-SYI。通過構建重組質(zhì)粒pET32a-CAT-SYI，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，成功表達出CAT-SYI的重組融合蛋白，而且在宿主體內(nèi)的表達量很高，說明本實驗將S.mutans的gtfS和gbpB的功能區(qū)域串聯(lián)起來表達的方法是可行的，這也進一步驗證了S.mutans重要毒力因子功能區(qū)的作用。Gtfs和GbpB是S.mutans重要的毒力因子，本實驗以該兩者的功能區(qū)構建的融合基因所表達蛋白制備的融合蛋白IgY，不僅能與重組融合蛋白發(fā)生特異性免疫反應，而且具有很高的效價，可達1∶100 000以上。利用斑點雜交進一步驗證了該融合蛋白IgY的功效，結果顯示它具有良好的識別S.mutans的能力。總之，本實驗利用基因工程手段成功制備出一種具有抑制S.mutans黏附的融合蛋白IgY，達到了預期的目的。但是本實驗初步證明了抗S.mutans融合蛋白IgY的免疫活性，還不足以說明該融合蛋白IgY就能夠有效的防治齲齒病，所以還需通過體內(nèi)試驗進一步證明它的防齲作用。

本研究利用基因工程技術獲得串聯(lián)基因CAT-SYI并成功構建重組質(zhì)粒pET32a-CAT-SYI從而表達出重組融合蛋白，再通過免疫手段制備出融合蛋白IgY，經(jīng)生物技術檢測方法證實了融合蛋白IgY與重組融合蛋白和S.mutans均具有良好的反應原性，為免疫防齲奠定了基礎。