謝亞鋒 匡小霞 許志杰 丁雅婷 閆圣玉 張 僑 劉菀瑩

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院肛腸科，衡陽421001)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是在全球范圍內(nèi)最常見的消化道腫瘤，其惡性程度高，在男性癌癥發(fā)病率中居第三位，而在女性癌癥發(fā)病率中居第二位。不僅如此，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，40歲以下的結(jié)直腸癌患者越來越多[1，2]。早期結(jié)直腸癌癥狀不明顯，容易被患者忽視，而就診時(shí)往往伴有多器官被侵犯、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況發(fā)生。因此對(duì)患者而言，治療的難度、費(fèi)用以及預(yù)后等都是沉重的負(fù)擔(dān)[3]。目前對(duì)結(jié)直腸癌的研究已有一定的認(rèn)識(shí)，其病情的發(fā)展是多個(gè)步驟序慣性的，不只是某個(gè)特定基因突變，而是各個(gè)階段不同基因改變的過程?，F(xiàn)階段對(duì)結(jié)直腸癌以手術(shù)治療為主，但多數(shù)腫瘤被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，且在手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，其他輔助治療效果不明顯，影響到患者的生存。所以對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制要進(jìn)一步研究，以便搜索更加有效地治療方式。

BS69是一種新近被確認(rèn)的細(xì)胞蛋白，研究發(fā)現(xiàn)這種蛋白既能與細(xì)胞蛋白如EMSY、c-Myb等[4]又可以與病毒蛋白[5]相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。但迄今為止，對(duì)BS69在腫瘤方面的研究主要是在乳腺癌和惡性血液病方面，在結(jié)直腸癌方面報(bào)道很少，本研究探討結(jié)直腸癌細(xì)胞系和患者組織中BS69蛋白和mRNA的表達(dá)情況，并分析與患者病理特征之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選擇2016年8月至2017年10月間我院手術(shù)切除、術(shù)后經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌的組織標(biāo)本60例，另取遠(yuǎn)離癌組織(離腫瘤邊緣10 cm)的25例正常組織作為對(duì)照，標(biāo)本提取后立即置于4%多聚甲醛中固定保存。在所有患者中，男性35例，女性25例；年齡≤65歲者44 例，>65歲者16例；局部淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者33例，轉(zhuǎn)移者27例；腫瘤直徑≤5 cm者27例，>5 cm者33例；按Dukes分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中A期 18例，B 期15例，C 期 14例，D 期13例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者13例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者47例；直腸癌28例，結(jié)腸癌32例；臨床分級(jí)：Ⅰ級(jí) 19例，Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)20例；所有結(jié)直腸癌病例術(shù)前均未接受放化療或免疫治療。

1.1.2試劑與儀器 兔抗人BS69多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體(Thermo公司)；SV0002-12兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL顯色試劑盒(Thermo公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢查BS69在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) 采用免疫組化SP法,取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，置于 pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中微波加熱修復(fù)，H2O2封閉，滴加適量稀釋的鼠抗人 BS69多克隆抗體，抗體稀釋濃度分別按1∶400，37℃ 2 h，PBS 沖洗8 min×3次，加入二抗(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS沖洗8 min×3次，DAB 顯色37℃ 20 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。以 PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽性反應(yīng)切片作為陽性對(duì)照。參照文獻(xiàn)[6]對(duì)BS69陽性表達(dá)進(jìn)行判定。BS69陽性染色主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞漿有少量存在，呈棕黃色或棕褐色顆粒;每張切片隨機(jī)取5 個(gè)高倍鏡視野，由兩名具有多年經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師雙盲計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例(陽性表達(dá)率)，≥10%為陽性反應(yīng)，<10%為陰性反應(yīng)。以0～3分對(duì)陽性表達(dá)率進(jìn)行評(píng)分，當(dāng)陽性表達(dá)率≤10%計(jì)0分，10%<陽性表達(dá)率≤50%計(jì)1分，50%<陽性表達(dá)率≤ 75%計(jì)2分，陽性表達(dá)率>75%計(jì)3分；染色強(qiáng)度為0～3分，未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；最終的評(píng)分為兩個(gè)指標(biāo)的乘積。其中3分以上為高表達(dá)。

1.2.2Western blot檢測(cè) 采用RIPA裂解液提取結(jié)直腸癌細(xì)胞系W480、HCT116 和 DLD1 及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系 FHC的總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)：制備 5%濃縮膠及 12%的分離膠。電泳：調(diào)解電壓至80 V、90 min后轉(zhuǎn)為100 V待溴酚藍(lán)跑至距分離膠底部0.5 cm時(shí)停止。轉(zhuǎn)膜：280 mA恒流1 h，結(jié)束后關(guān)閉電源取出PVDF膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現(xiàn)說明轉(zhuǎn)膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗：用TBS稀釋BS69(1∶200)、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱過夜。加二抗37℃ 2 h，結(jié)束后用TBST漂洗10 min×3次，后顯影。用 Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)定其吸光度值。BS69蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=BS69蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.2.3RT-qPCR 法檢測(cè)BS69的mRNA水平 按照Trizol試劑盒說明書分別提取癌及癌旁組織的總RNA，并測(cè)定濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成，反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95℃ 5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸 30 s，循環(huán) 40 次。實(shí)時(shí)熒光使用 ABI PRISM 7500 Sequence Detector 檢測(cè)。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，BS69上游引物序列:5′-AGTCTG-GCCCACGGACCAT-3′，下游引物:′-CCAGTTTGT-CTCTCCCTG-3′。以GAPDH蛋白為內(nèi)參，上游引物:5′-GGATCCCTCCAGAGCGAAAAT-3′，下游引物:5′-GTCATACTTCTGCTGTTGCATGG-3′。用系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析：樣品的相對(duì)表達(dá)用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=結(jié)直腸癌ΔCt-正常結(jié)直腸黏膜組織ΔCt。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中BS69的表達(dá) 采用免疫組化法對(duì)60例結(jié)直腸癌和25例癌旁正常組織中BS69 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示BS69主要在細(xì)胞核上表達(dá)呈棕褐色、棕黃色顆粒。BS69在癌組織和正常組織中的陽性表達(dá)率分別為65%(39/60)和88%(22/25)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過免疫組化圖可以觀察出，BS69在多數(shù)癌旁正常組織中陽性細(xì)胞數(shù)較多，顏色較深，而陽性細(xì)胞在結(jié)腸癌組織中較少，顏色較淺，詳見表1、圖1。

2.2結(jié)直腸癌組織中BS69的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性 BS69在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)、Dukes 分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。在組織分級(jí)中，BS69在Ⅰ、Ⅱ級(jí)中的陽性蛋白表達(dá)率要高于Ⅲ級(jí)中的表達(dá)(P=0.015)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比BS69蛋白陽性率明顯上升(P=0.007)，而有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者相比蛋白陽性率明顯降低(P=0.038)，Dukes 分期 A/B 期中的BS69陽性蛋白表達(dá)率與C/D 期相比明顯上升(P=0.007)，詳見表2。

表1 BS69在結(jié)直腸癌和正常組織中表達(dá)差異

圖1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中BS69的表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical detection of BS69 expression in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissuesNote: A.Normal colorectal tissues;B.Highly differentiated colorectal cancer tissues;C.Middle differentiated colorectal cancer tissues;D.Poorly differentiated colorectal cancer tissues.

2.3Western blot檢測(cè)BS69蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BS69在FHC、DLD-1、SW480、HCT116細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為 0.28±0.05、0.10±0.02、0.77±0.10、0.08±0.01，其中SW480細(xì)胞系中BS69蛋白表達(dá)最高，而 HCT116細(xì)胞系中BS69蛋白表達(dá)水平最低，且低于FHC中蛋白表達(dá)，詳見圖2。

2.4BS69 mRNA的表達(dá)情況 統(tǒng)計(jì)60例結(jié)直腸癌與25例癌旁正常組織的RT-qPCR數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織的 2-ΔΔCt均值為0.357±0.175，癌旁正常對(duì)照組織的2-ΔΔCt均值為1.000±0.224。結(jié)果相比于癌旁正常組織，癌組織中BS69的mRNA水平相對(duì)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 結(jié)直腸癌組織中BS69的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性

圖2 Western blot檢測(cè)BS69蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.2 Western blot to detect the expression of BS69 protein in various cell linesNote: 1.FHC;2.DLD-1;3.SW480;4.HCT116.

3 討論

結(jié)直腸癌是在各種腫瘤致病因素作用下，腸道黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生基因改變導(dǎo)致其無法對(duì)生長進(jìn)行調(diào)控，細(xì)胞周期發(fā)生紊亂、惡性增生而形成的一種消化道惡性腫瘤。文獻(xiàn)報(bào)道[7]結(jié)直腸癌的發(fā)生率已居于癌癥前三位，并可能在短時(shí)間內(nèi)上升至第一，從臨床醫(yī)學(xué)角度看，對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行手術(shù)治療以及放化療等都可以獲得有效治療，但研究顯示癌癥患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移，而結(jié)直腸癌最主要轉(zhuǎn)移部位是肝臟，初診時(shí)肝轉(zhuǎn)移病灶僅10%～20%能夠被徹底清除，絕大多數(shù)仍累及大血管，導(dǎo)致患者預(yù)后恢復(fù)差，中位生存期僅1年[8，9]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制與信號(hào)傳導(dǎo)通路中的有關(guān)分子異?；罨⒈磉_(dá)有關(guān)，其發(fā)病是一個(gè)多基因、多步驟、多因素的復(fù)雜過程。

Hateboer等[10]首次發(fā)現(xiàn)的BS69 是一種腺病毒E1A 結(jié)合蛋白，這種蛋白能與E1A特異性結(jié)合，還可以抑制COS-7細(xì)胞中E1A的反式激活作用。Hateboer等[10]還用Northern雜交的方法，研究小鼠不同組織中BS69表達(dá)情況，并在所有被檢測(cè)組織中發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦、肺、睪丸中表達(dá)水平較低，而在腎臟中的表達(dá)量最高。同時(shí)作為一種腺病毒結(jié)合蛋白，BS69通過289R EIA腫瘤蛋白抑制反式激活，在與各種轉(zhuǎn)錄因子的聯(lián)系中起到協(xié)同抑制作用，對(duì)EIA的轉(zhuǎn)錄及反式活化起到抑制效果。但到目前為止，BS69依舊有很多生物學(xué)功能及特點(diǎn)仍未研究透徹。除此之外，BS69 還可能在細(xì)胞衰老過程中起到作用[11]。例如在人的原代成纖維細(xì)胞 IMR90中，使用RNA對(duì)BS69進(jìn)行干擾能使其表達(dá)水平下降，原代成纖維細(xì)胞擴(kuò)增速度變得非常緩慢，這說明 BS69 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控有一定作用[12]；與此用時(shí)，研究者還發(fā)現(xiàn) BS69作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的抑制因子，在各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)。BS69在病毒、細(xì)胞中與蛋白相互作用，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制功能。同時(shí)對(duì)組蛋白H3.3K36me3甲基化修飾特異性識(shí)別，對(duì)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起到延長作用，因此BS69被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制因子和潛在的腫瘤抑制因子，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

在本次研究中采用免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌及正常組織中BS69蛋白的陽性表達(dá)率，結(jié)果分別為88%(22/25)和65%(39/60)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這說明在結(jié)直腸癌組織中BS69的基因編碼可能發(fā)生變異，下調(diào)其蛋白表達(dá)水平。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)少數(shù)癌組織中BS69表達(dá)呈強(qiáng)陽性，同時(shí)結(jié)直腸癌系細(xì)胞的Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞系中BS69蛋白表達(dá)最高，這和少數(shù)結(jié)直腸癌組織中BS69的強(qiáng)陽性結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)還采用RT-qPCR法檢測(cè)BS69在癌組織和正常組織中的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果與免疫組化蛋白陽性率趨勢(shì)基本一致，在結(jié)直腸癌組織中BS69 mRNA的表達(dá)水平與癌旁正常組織相比顯著下降，說明BS69可能在基因的轉(zhuǎn)錄階段已經(jīng)出現(xiàn)缺失。結(jié)直腸癌細(xì)胞系Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BS69在SW480細(xì)胞系中表達(dá)最高，而 HCT116細(xì)胞系中表達(dá)水平最低，且低于FHC中蛋白表達(dá)，這些提示BS69并不是在所有結(jié)直腸癌中低表達(dá)，這可能與不同細(xì)胞系的惡性程度有關(guān)。在BS69與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性研究中，BS69 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)、Dukes 分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與患者的腫瘤直徑、腫瘤部位、性別、年齡均無明顯關(guān)系(P>0.05)，表明 BS69 低表達(dá)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，BS69 在正常組織中高表達(dá)、結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，因此可以被認(rèn)為是一種潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子和腫瘤抑制因子，但在部分結(jié)直腸癌中出現(xiàn)異常高表達(dá)，說明可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，檢測(cè)癌組織中BS69表達(dá)有助于對(duì)結(jié)直腸癌惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后展開進(jìn)一步研究和判斷。