黃 薇 榮 黎 陳耀凱 歐陽凈 王 麗 李本杰 趙學(xué)蘭

(西南政法大學(xué)醫(yī)院,重慶401120)

胃癌是臨床最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率高，治愈率低，嚴重威脅人類健康。提升腫瘤防治水平離不開新藥的研發(fā)，而中醫(yī)藥作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)藥物，值得我們傳承和發(fā)展，近年來中藥治療腫瘤受到廣泛關(guān)注。已有研究結(jié)果顯示，紅景天甙在白血病、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中具有抗腫瘤效應(yīng)，但其在胃癌中的治療作用及機制研究鮮有報道，值得我們關(guān)注。因此，本課題組擬觀察紅景天甙對胃癌細胞增殖、凋亡、細胞周期等生物學(xué)行為的影響，為進一步探討其可能的作用機制奠定重要的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人胃癌細胞株MKN-45、MKN-28、SGC7901由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈。

1.1.2主要試劑和儀器 紅景天苷購于南京格爾狄生物科技有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)基 (Hyclone公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；RT-PCR試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；CCK-8試劑盒(Dojindo公司，日本)；Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司，北京)；Transwell小室(Milipore公司，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組 人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901和MKN-45分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，細胞長滿培養(yǎng)瓶的90%時進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。以不含紅景天甙的1640培養(yǎng)基作為對照組，以不同濃度紅景天甙處理的胃癌細胞為實驗組。

1.2.2CCK-8法檢測紅景天甙對胃癌細胞增殖的影響 選取80%～90%生長密度且狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的胃癌細胞以5×104/孔鋪于96孔板中，加入PBS溶解的不同濃度的紅景天甙，每組均設(shè) 3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng) 48 h后，1 700 r/min離心5 min，小心棄去細胞上清，同時加入含 10 μl CCK-8試劑避光孵育1 h，使用酶標儀進行雙波長(490 nm和630 nm) 檢測 OD值，計算IC50并繪圖。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3Annexin-V/PI流式細胞術(shù)檢測紅景天甙對細胞凋亡的影響 消化細胞并計數(shù)，鋪細胞至6孔板中，使每孔細胞數(shù)量為1×106，24 h后觀察細胞密度，待細胞密度為80%左右，加入不同濃度的紅景天甙處理細胞。48 h后，首先觀察細胞形態(tài)變化，然后分別將對照組及紅景天甙處理組的培養(yǎng)基收集10 ml于無菌離心管中(收集懸浮細胞)，800 r/min離心5 min，棄上清，離心同時消化貼壁的細胞，將貼壁細胞收集到含有懸浮細胞的離心管中，同樣轉(zhuǎn)速離心5 min，輕輕倒掉上清，加入PBS輕輕重懸洗3次，同樣的轉(zhuǎn)速離心后輕輕棄去上清，放置冰上。具體方法如下，每孔10 μl Annexin-V和190 μl結(jié)合液配制混合液，混勻后重懸離心管中的細胞沉淀，冰上避光孵育10 min，加入碘化丙啶 5 min后使用BD流式細胞儀進行檢測。

1.2.4Hoechst細胞核染色觀察紅景天甙對細胞凋亡的影響 將細胞(1×105)接種到含有無菌玻片的24孔板中，用含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別用不同濃度的紅景天甙處理細胞48 h，PBS洗3次，500 μl 4%的多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗3次，以1∶20的方法用PBS稀釋DAPI，每孔200 μl稀釋液常溫染色10 min，PBS洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5qRT-PCR檢測Bcl-2、Bcl-xl、Bax表達變化 使用不同濃度的紅景天甙處理胃癌細胞，48 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍為模板，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)。使用SYBR GreenⅡ熒光染料檢測，PCR擴增程序為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55℃退火15 s；72℃延伸30 s，共39個循環(huán)，定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析，ΔΔCt=ΔCt(紅景天甙處理組)-ΔCt(空白對照組)，ΔCt(紅景天甙處理組)=Ct(紅景天甙處理組,目的基因)-Ct(紅景天甙處理組,內(nèi)參基因)，ΔCt(空白對照組)=Ct(空白對照組,目的基因)- Ct(空白對照組,內(nèi)參基因)。

1.2.6流式細胞儀檢測紅景天甙對胃癌細胞周期的影響 細胞接種于6孔板，培養(yǎng)36 h，進行不同濃度紅景天甙干預(yù)，培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化細胞，冷PBS洗滌2次，棄上清，加4℃預(yù)冷的70%冰乙醇固定細胞30 min，冷PBS洗滌2次，重懸細胞，調(diào)整細胞密度為個1×106ml-1，加入100 μl RNaseA，37℃水浴30 min，加入400 μl PI染色劑混勻，4℃避光30 min。將樣品加入流式細胞儀樣品室，進行單色熒光細胞流式計數(shù)。

1.2.7Transwell檢測紅景天甙對胃癌細胞遷移能力的影響 將ECM基質(zhì)膠按1∶7的比例用無血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋后，取30 μl均勻地加在Transwell小室底部膜的上室面，紫外線照射過夜，使ECM基質(zhì)膠自然聚合成凝膠。將各組胃癌細胞用無雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，以5 000 個細胞/孔加入Transwell上層小室中，培養(yǎng)24 h 后，用濕棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，經(jīng)無水乙醇固定15 min，結(jié)晶紫染色，光鏡下觀察，并隨機選取5個 視野，計數(shù)每個視野下穿膜細胞，并取平均值，以穿膜細胞的數(shù)目代表胃癌細胞的體外遷移能力。

2 結(jié)果

2.1紅景天甙對胃癌細胞增殖的影響 隨著紅景天甙濃度的增加，高、中、低分化胃癌細胞MKN-28、SGC-7901和MKN-45的增殖速率均受到顯著抑制(見圖1)，并且抑制程度呈濃度依賴性，IC50值分別為(19.17±0.14)μg/ml、(25.70±0.21)μg/ml、(38.06±0.19)μg/ml。

2.2流式細胞術(shù)檢測紅景天甙對胃癌細胞凋亡的影響 MKN-28、SGC-7901和MKN-45分別采用20、25、40 μg/ml的紅景天甙處理48 h后，流式細胞檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，紅景天甙處理組細胞的凋亡率顯著增加。MKN-28、SGC-7901和MKN-45細胞凋亡率分別為(28.3±2.8)%、(32.7±2.5)%、(25.5±2.1)%，顯著高于對照組細胞凋亡率(5.5±1.3)%、(8.3±1.5)%、(6.7±1.6)%(見圖2)。

2.3Hoechst染色觀察紅景天甙對胃癌細胞核形態(tài)的影響 細胞核染色質(zhì)固縮現(xiàn)象是伴隨著凋亡發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。Hoechst33258染色結(jié)果顯示，紅景天甙處理MKN-28細胞后出現(xiàn)細胞核染色質(zhì)固縮，這一結(jié)果從細胞形態(tài)學(xué)上說明紅景天甙促進胃癌細胞凋亡的發(fā)生(見圖3)。

圖1 CCK8法檢測紅景天甙對胃癌細胞的增殖影響Fig.1 Effect of salidroside on proliferation of gastric cancer cells with CCK8 assay

圖2 流式細胞檢測紅景天甙對胃癌細胞凋亡的影響Fig.2 Flow cytometry was used to detect effect of salidroside on apoptosis of gastric cancer cells

2.4紅景天甙對胃癌細胞MKN-28周期分布的影響 流式細胞結(jié)果顯示，與對照組相比，MKN-28細胞經(jīng)紅景天甙處理后G2/M期的細胞比例顯著增加，由(15.73±2.1)%增加到(45.47±3.6)%，與此相反G0/G1期的細胞比例明顯減少，由(73.52±4.5)%降低到(36.63±3.9)%(見圖4)，說明MKN-28細胞周期被阻滯在G2/M期不再分裂。

2.5qRT-PCR觀察紅景天甙對胃癌細胞凋亡基因的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，紅景天甙處理后，在兩種胃癌細胞MKN-28和MKN-45中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表達下調(diào)，而促凋亡基因Bax表達上調(diào)，進一步佐證紅景天甙促進胃癌細胞凋亡發(fā)生(見圖5)。

圖3 紅景天甙促進MKN-28胃癌細胞凋亡Fig.3 Salidroside promotes apoptosis of MKN-28 gastric cancer cellsNote: The arrow indicates chromatin concentration.

圖4 流式細胞檢測紅景天甙對MKN-28細胞周期影響Fig.4 Flow cytometry was used to detect effect of salidroside on MKN-28 cell cycle

圖5 實時熒光定量PCR結(jié)果提示紅景天甙抑制抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的表達，促進凋亡基因Bax的表達Fig.5 Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect expression of apoptotic genes

圖6 Transwell小室實驗檢測紅景天甙對MKN-28細胞遷移能力的影響Fig.6 Transwell chamber assay was performed to deter-mine effect of salidroside on MKN-28 cell migration

2.6紅景天甙對胃癌細胞MKN-28遷移能力的影響 我們應(yīng)用Transwell小室實驗檢測紅景天甙處理MKN-28后細胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示,與對照組穿過基底膜的細胞數(shù)量為286±13相比，紅景天甙處理組穿過基底膜的細胞數(shù)量為47±5(見圖6)，說明紅景天甙明顯抑制MKN-28胃癌細胞的遷移能力。

3 討論

胃癌是全球最常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)胃癌的年發(fā)病數(shù)接近100萬，發(fā)病率位居惡性腫瘤第四位；而年死亡數(shù)超過70萬，在惡性腫瘤中占到第二位[1]。我國每年的胃癌新發(fā)病例數(shù)占到全球的52%，高居我國消化道腫瘤發(fā)病率的首位[2,3]。多數(shù)胃癌患者早期臨床癥狀不明顯，通常確診時已是晚期，手術(shù)難以達到預(yù)期，而常規(guī)放化療對胃癌不甚敏感。盡管不斷有胃癌藥物的研發(fā)應(yīng)用，但諸如費用昂貴、靶向性差、僅對部分患者起效、腫瘤耐藥或藥物毒副作用等原因，導(dǎo)致目前胃癌的藥物治療仍不盡如人意[4]。而中藥在腫瘤的治療中具有毒副作用小、價格相對低廉等特點，所以新的天然化合物的發(fā)掘與評價已經(jīng)備受關(guān)注。

紅景天為景天科紅景天屬(Rhodiola L.)多年生草本或亞灌木植物[5-7]，而紅景天甙(Salidroside)為紅景天的天然提取物。已有研究結(jié)果表明，紅景天甙不但有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗病毒、抗衰老的作用，還具備抗纖維化、增強免疫等功效，是一種具有開發(fā)前景的天然化合藥物[8-14]。解方為等[15]將紅景天甙作用于肝癌SMMC-7721細胞，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞出現(xiàn)增殖抑制。Mishra等[16]研究顯示，紅景天提取物可顯著抑制人白血病K-562細胞的增殖，并促進白血病細胞凋亡，同時能阻滯腫瘤細胞于G2/M期 。Hu等[17]通過實驗發(fā)現(xiàn)：紅景天甙通過調(diào)節(jié)CDK4-cyclin D1通路阻滯細胞于G1期，調(diào)節(jié)Cdc2-cyclin B1通路阻滯細胞于G2期，從而抑制腫瘤細胞生長。

我們查閱大量文獻后發(fā)現(xiàn)，目前紅景天甙在胃癌中的治療作用鮮有報道，僅有國內(nèi)韋麗蘭等[18]于2015年首次利用部分體外實驗初步發(fā)現(xiàn)紅景天甙對胃癌SGC7901有生長抑制作用，但該研究結(jié)果尚有待進一步證實，同時更需要相關(guān)分子機制層面的深入探討和研究。而本課題組的前期初步實驗表明：紅景天甙對不同分化程度的胃癌細胞均具有明顯的增殖抑制，且抑制程度呈濃度依賴性，這與韋麗蘭等[18]的研究結(jié)果一致。并且我們首次通過AV/PI熒光雙染流式細胞術(shù)、Hoechst33258細胞核染色以及qRT-PCR三種方法從多角度、多層面有力證實了紅景天甙對胃癌細胞的促凋亡效應(yīng)。同時我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紅景天甙處理后胃癌細胞G2/M期的細胞比例顯著增加，G0/G1期的細胞比例明顯減少，表明細胞周期被阻滯在G2/M期不再分裂，這與 Hu等[17]的研究相似。進而我們還首次通過Transwell小室實驗觀察到紅景天甙可以使穿膜細胞數(shù)明顯減少，提示紅景天甙明顯抑制胃癌細胞的遷移能力。

總之，本研究結(jié)果顯示，紅景天甙對胃癌細胞的多種生物學(xué)行為均具有拮抗作用，進而提示了紅景天甙應(yīng)用于臨床胃癌患者的潛在治療效應(yīng)。上述實驗結(jié)果為本課題組進一步研究紅景天甙抗胃癌效應(yīng)的相關(guān)分子機制提供了重要的實驗依據(jù)。同時，為應(yīng)用紅景天甙治療臨床腫瘤患者提供了重要的理論基礎(chǔ)。