肖 磊，楊 苑，李瑞航，謝利萍，邵景俠，郭藹光,2，徐 虹,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

本研究用二甲基聯(lián)苯胺(DAB)組織染色法測定返白系和矮變1號在4 ℃持續(xù)低溫條件及25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)下葉片H2O2的含量；同時測定低溫處理下返白系和矮變1號幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，用qRT-PCR分析主要光合電子傳遞體基因以及清除質(zhì)體活性氧相關(guān)酶類基因的表達(dá)量；分析返白系和矮變1號在低溫處理下葉片H2O2的含量是否存在差異，并初步分析導(dǎo)致差異的生理與分子機(jī)制，以期為深入探究ROS與返白系葉色白化的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試材料為冬小麥品種矮變1號和返白系，種子獲贈于陜西省西安市農(nóng)科所李丕皋研究員，由實(shí)驗(yàn)室長期保存。挑選整齊一致的小麥種子，在室溫下用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，長到一葉一心期時移至4 ℃低溫人工氣候箱中，培養(yǎng)條件：光暗周期16/8 h，有效光量子密度250 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%，持續(xù)低溫培養(yǎng)約90 d至返白系葉片全白，之后移至25 ℃人工氣候箱培養(yǎng)10 d待葉片復(fù)綠。

1.2 小麥葉片中H2O2含量的檢測

選取4 ℃低溫處理0、5、10、20、30和90 d，以及25 ℃復(fù)綠培養(yǎng)2、5和10 d后的小麥倒一展開葉，將去除葉尖后剩余的長約2.5 cm、寬約1 cm的葉片放入DAB染色液(0.1% 二甲基聯(lián)苯胺，0.1% Tween-20，用HCl調(diào)至pH5.6)中，避光染色24 h，之后將葉片放入脫色液(10%冰醋酸，10%丙三醇，用無水乙醇配制)中，加熱煮沸10 min脫色，4 ℃放置過夜后在體式顯微鏡下觀察拍照。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

選取小麥幼苗的倒一展開葉進(jìn)行測量。將小麥葉片平放在潤濕的濾紙上避光30 min后，立即放進(jìn)葉綠素?zé)晒獬上駜x中進(jìn)行測量，按照軟件操作指南進(jìn)行相關(guān)參數(shù)設(shè)定：Act1=20，Super=20，Shutter=20，Sensitivity = 40。選取葉片基部，用FluorCam Software 7.0軟件分析小麥葉片的原初光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP的變化，每組處理測定3～5株小麥。

1.4 相關(guān)基因表達(dá)量的qRT-PCR檢測

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期基因芯片檢測數(shù)據(jù)，結(jié)合葉綠體基因表達(dá)譜，篩選出返白系與矮變1號中與光合電子傳遞、活性氧清除相關(guān)且表達(dá)有差異的基因。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)中比對這些基因，確定序列保守區(qū)域，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。

表1 實(shí)時定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

以各組處理的小麥幼苗心葉為材料，Trizol法提取心葉總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用ddH2O稀釋cDNA樣品至200 ng·μL-1左右，置-80 ℃?zhèn)溆?。使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa，日本)，在公司CFX-96型熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上以TaARF(ADP-ribosylation factor)基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測基因的表達(dá)量變化。每個反應(yīng)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)Ct值，利用公式2-△△Ct計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理與升溫過程中返白系和矮變1號小麥葉片H2O2含量的動態(tài)變化

二氨基聯(lián)苯胺(DAB)滲透到植物組織中后可與細(xì)胞中的H2O2迅速反應(yīng)，生成紅棕色聯(lián)苯胺腙沉淀，紅棕色程度深淺可以顯示細(xì)胞中H2O2的含量。用DAB染色法，檢測低溫持續(xù)處理90 d的過程中，及升溫復(fù)綠10 d過程中返白系葉片H2O2含量的動態(tài)變化，用矮變1號作為對照，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1顯示，低溫處理前，返白系與矮變1號幼苗葉片H2O2含量基本一致。4 ℃低溫處理后，短期內(nèi)(5和15 d)，矮變1號葉片H2O2含量無明顯變化，長期(30和90 d)低溫處理后矮變1號葉片的H2O2含量略有增加。與矮變1號相比，返白系葉片在低溫處理5 d時顏色就有較明顯加深，隨著低溫處理時間的延長，H2O2含量持續(xù)增加，在低溫處理90 d葉片全白時，葉片已呈明顯的紅棕色，H2O2含量達(dá)到最高值。表明低溫脅迫下返白系葉片中H2O2的含量明顯高于矮變1號，持續(xù)低溫引起了返白系葉片中H2O2的大量累積。

將低溫處理90 d的小麥幼苗移至25 ℃培養(yǎng)，可使白化的返白系葉片在短時間內(nèi)復(fù)綠。由圖2看出，隨著25 ℃培養(yǎng)時間的延長，小麥葉片的染色逐漸變淺，25 ℃培養(yǎng)下5 d的返白系葉片著色與低溫處理5 d接近， 25 ℃培養(yǎng)10 d后葉片著色與低溫處理前基本一致。說明葉片中H2O2的含量隨著溫度的上升迅速下降，直至恢復(fù)到低溫處理前的水平，外界溫度條件調(diào)控了返白系葉片中H2O2的含量。

2.2 低溫處理下返白系和矮變1號小麥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

本研究采用了Fv/Fm和qP兩個葉綠素?zé)晒鈪?shù)來反映返白系在低溫條件下葉綠體光合電子傳遞能力。Fv/Fm是最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，即原初光能轉(zhuǎn)化效率。逆境脅迫下Fv/Fm明顯下降，是植物抗冷性的主要敏感指標(biāo)。qP是光化學(xué)淬滅系數(shù)，表示由光合作用引起的熒光淬滅，反映了PSⅡ的天線色素分子將其所吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，也可反映PSⅡ原初電子受體QA的還原狀態(tài)。Fv/Fm和qP值的降低會引起質(zhì)體ROS的累積。

從圖3可以看出，當(dāng)?shù)蜏靥幚?0 d時，返白系表現(xiàn)出自葉片基部的黃化，對應(yīng)區(qū)域的Fv/Fm和qP值低于矮變1號。當(dāng)?shù)蜏靥幚?0 d時，返白系的葉片表現(xiàn)為全白，此時的Fv/Fm和qP也幾乎檢測不到。由此可知，低溫脅迫下，返白系葉片的光合電子傳遞效率和光合活性低于矮變1號。

A:矮變1號；F:返白系。下圖同。

圖2 室溫(25 ℃)復(fù)綠過程中小麥葉片H2O2含量的變化

2.3 低溫處理下返白系和矮變1號小麥中與質(zhì)體H2O2累積相關(guān)基因的表達(dá)模式

對4個光合電子傳遞體亞基基因ndhB、ndhK、petD和petN，以及4個質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因APX4、tAPX、sAPX和HO1進(jìn)行實(shí)時定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4和圖5所示。

ndhB和ndhK是NDH復(fù)合體的亞基基因，petD和petN是Cytb6f復(fù)合體亞基基因，這4個基因都是由葉綠體編碼。由圖4看出，這4個基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)很敏感，短時間低溫就可誘導(dǎo)4個基因的表達(dá)上調(diào)，ndhB在低溫2 d表達(dá)量達(dá)到最大值，其他3個基因的表達(dá)量分別在低溫10 d和20 d 達(dá)到峰值，之后則持續(xù)下調(diào)。溫度回升后，基因表達(dá)量又逐漸上調(diào)。低溫條件下，返白系中4個基因的相對表達(dá)量幾乎都顯著低于矮變1號，在低溫處理30 d和90 d葉片全白時，返白系和矮變1號中4個基因的表達(dá)水平差異非常明顯，這與圖2中返白系葉片的Fv/Fm和qP值明顯低于矮變1號相一致，光合電子傳遞體相關(guān)基因的表達(dá)水平低于矮變1號可能是返白系光合電子傳遞效率降低的部分原因。

圖5顯示，低溫條件下，4個基因在返白系中分別表現(xiàn)為先上調(diào)再下調(diào)(APX4、tAPX和HO1) 或上-下-上的變化模式(sAPX)。矮變1號與返白系基本一致，但APX4基因在持續(xù)低溫90 d時上調(diào)表達(dá)。說明這4個基因可以對低溫做出積極的響應(yīng)，但每個基因?qū)Φ蜏氐拿舾谐潭群晚憫?yīng)的模式不同。

Fv/Fm:最大光化學(xué)量子產(chǎn)量; qP:光化學(xué)淬滅系數(shù)。

比較兩種材料基因的表達(dá)量后看出，低溫處理前，在兩個材料間除sAPX基因差異不顯著外，其余3個基因均表現(xiàn)為返白系中的表達(dá)量顯著高于矮變1號。返白系中的APX4基因在低溫處理5 d、HO1基因在低溫處理20 d后，相對表達(dá)量就一直顯著低于矮變1號；至低溫90 d時，除sAPX外的其他3個基因均是返白系中的表達(dá)量顯著低于矮變1號。當(dāng)溫度升高至25 ℃后，返白系中除sAPX外的其他3個基因表達(dá)量均表現(xiàn)為上調(diào)，至25 ℃處理10 d時，4個基因在返白系中的表達(dá)量又都略微或者顯著高于矮變1號。這些結(jié)果表明，相對于矮變1號，低溫抑制了返白系中APX4與HO1的表達(dá)，返白系中APX4與HO1的低水平表達(dá)減弱了清除質(zhì)體中過量H2O2的能力，這可能是長期低溫條件引起返白系中H2O2累積的重要原因之一。

3 討 論

低溫會影響光合器官的結(jié)構(gòu)和活性，影響光合電子傳遞和光合磷酸化過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下，相較于矮變1號，返白系葉片會累積大量的H2O2；通過測定低溫處理下返白系和矮變1號葉片中表征光合電子傳遞效率的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、qP，發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時間的延長，返白系葉片中Fv/Fm、qP值明顯降低，揭示出低溫脅迫下返白系葉片的光合電子傳遞受阻，電子傳遞鏈效率降低，可能會發(fā)生嚴(yán)重的電子滲漏，并通過Mehler反應(yīng)和SOD催化生成大量的H2O2。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下，返白系光合電子傳遞鏈中NDH復(fù)合體的亞基基因ndhB、ndhK以及Cytb6f復(fù)合體亞基基因petD和petN的表達(dá)量都顯著低于矮變1號。NDH復(fù)合體和Cytb6f復(fù)合體是葉綠體中光合電子傳遞鏈中必不可少的組分和反應(yīng)場所[22]，返白系中ndhB、ndhK、petD和petN較低的表達(dá)水平可能是低溫處理下返白系中光合電子傳遞的效率明顯低于矮變1號的重要原因，導(dǎo)致電子由PS中心流向NADP的途徑受阻，產(chǎn)生電子泄露，并最終生成H2O2。

A：矮變1號；F：返白系。*和**分別表示在相同處理?xiàng)l件下返白系與矮變1號之間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下圖同。

細(xì)胞中活性氧的濃度是由產(chǎn)生和清除兩種途徑控制的[10]。本研究對低溫處理下返白系和矮變1號中質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因APX4、tAPX、sAPX和HO1的qRT-PCR結(jié)果表明，在低溫處理下，返白系中APX4和HO1的表達(dá)水平顯著低于矮變1號。APX4和HO1在清除質(zhì)體過量的H2O2上發(fā)揮著重要作用，其中APX是一種亞鐵血紅素蛋白，它以抗壞血酸為電子供體將H2O2分解為水，APX4可以與血紅素結(jié)合, 具有抗氧化活性，能夠清除葉綠體中的ROS[12]。過表達(dá)chlAPX和HO可以增強(qiáng)植物的抗氧化脅迫和抗逆性[14,23]。低溫處理下返白系質(zhì)體中APX4和HO1相對較低的表達(dá)量意味著低溫處理下返白系質(zhì)體(特別是基粒類囊體)中大量積累的H2O2不能得到有效清除，使得返白系質(zhì)體中H2O2維持在較高的水平。一方面，低溫處理下返白系中由于光合電子傳遞受阻，電子泄露，最終反應(yīng)生成大量H2O2；另一方面，低溫處理下，返白系中清除質(zhì)體H2O2的關(guān)鍵酶APX4和HO1的表達(dá)水平較低，質(zhì)體H2O2清除能力減弱，共同作用下導(dǎo)致了低溫處理下返白系葉片中H2O2的大量累積。低溫處理下返白系葉片累積的H2O2可能與低溫誘導(dǎo)白化現(xiàn)象存在相關(guān)性，其對葉色白化的影響還有待于深入研究。

圖5 質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因表達(dá)分析