謝 磊，戰(zhàn)帥帥，王麗麗，任 毅，時 佳，耿洪偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點實驗室,新疆烏魯木齊 830052)

面粉色澤是決定小麥品質(zhì)的重要因素[1]，小麥籽粒過氧化物酶(peroxidase, POD)活性是影響面粉及面制品色澤的重要指標(biāo)之一。籽粒POD活性與面團(tuán)及面制品褐變程度高度正相關(guān)[2-3]，高POD活性可以提高小麥面粉及其產(chǎn)品的白度從而提高其商品價值。POD不僅能催化阿魏酸等主要酚酸的氧化，產(chǎn)生發(fā)色基團(tuán)(如醌式結(jié)構(gòu))，使面粉中的無色前體物質(zhì)形成有色物質(zhì)，也能氧化降解面粉中的色素類物質(zhì)(如類胡蘿卜素)，是面粉和面制品在加工和儲藏過程中發(fā)生褐變和黃色被漂白的主要原因[4-6]。同時，在面制品加工的面團(tuán)混合過程中，POD催化所形成的產(chǎn)物在面制品烘烤過程中部分被破壞形成揮發(fā)物(如正己醛)，增加面制品香氣。籽粒中的POD是面包、饅頭和面條等面制品白度的重要影響因素[7]，與脂肪氧化酶(lipoxygenase, LOX)相比，POD能較少的破壞面制品風(fēng)味，從而取代LOX作為主要的食品添加劑[8-9]。

環(huán)境與基因型均對POD活性有影響，但主要受遺傳因素影響[10-11]。前人根據(jù)水稻、玉米等禾本科作物基因共線性原理，對普通小麥POD基因進(jìn)行QTL定位，結(jié)果表明，普通小麥POD基因位于第3和第7同源染色體上[12-13]。時 佳等[14]利用90K iSelect 芯片對黃淮麥區(qū)151份及北部冬麥區(qū)82份小麥品種的籽粒POD基因進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)，檢測到多個穩(wěn)定遺傳的位點，分別位于2A、2D、5A、6A、7B和7D等染色體上。在檢測到的多環(huán)境穩(wěn)定遺傳的位點中，2D染色體上的位點(97～100 cM)在3個環(huán)境中均能檢測到，是比較穩(wěn)定的遺傳位點；7D染色體上位點的貢獻(xiàn)率最大，介于18.0%～21.4%之間，并針對7D染色體的POD基因開發(fā)了能應(yīng)用于育種實踐的顯性互補(bǔ)標(biāo)記POD-7D1與POD-7D6。POD-7D1 能在具有等位基因TaPod-D1a(與高POD活性相關(guān))的材料中擴(kuò)增出 540 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-D1b(與低POD活性相關(guān))的材料中無擴(kuò)增產(chǎn)物；POD-7D6 能在具有等位基因TaPod-D1b的材料中擴(kuò)增出 640 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-D1a的材料中無擴(kuò)增產(chǎn)物。魏景欣等[15]利用豆麥/石4185重組自交系(recombinant inbred lines，RIL)群體的214個株系和7 391個SNP標(biāo)記及一個新開發(fā)的STS標(biāo)記對普通小麥POD活性進(jìn)行了QTL分析，共檢測到3個QTL；并針對3A染色體的POD基因開發(fā)了顯性互補(bǔ)標(biāo)記POD-3A1與POD-3A2。POD-3A1能在具有等位基因TaPod-A1a(與低POD活性相關(guān))的材料中擴(kuò)增出 291 bp 的片段，而在具有等位基因TaPod-A1b(與高POD活性相關(guān))的材料中無擴(kuò)增條帶；POD-3A2能在具有等位基因TaPod-A1b的材料中擴(kuò)增出 766 bp 的片段，在具有等位基因TaPod-A1a的材料中無擴(kuò)增條帶。時 佳等[14]分別利用TaPod-D1和TaPod-A1位點開發(fā)的四對互補(bǔ)顯性功能標(biāo)記，檢測兩個不同麥區(qū)的224份小麥材料的POD活性，并通過對比分析四個不同基因型組合平均POD活性間的顯著性差異，發(fā)現(xiàn)四個不同基因型組合的品種POD活性高低排列順序為TaPod-D1a/TaPod-A1b>TaPod-D1b/TaPod-A1b>TaPod-D1a/TaPod-A1a>TaPod-D1b/TaPod-A1a；并且含有兩個高POD活性等位基因TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種(系)的POD活性顯著高于含有單個高POD活性等位基因TaPod-D1a或TaPod-A1b的品種(系)。

盡管目前已有許多和新疆小麥色澤與其他性狀關(guān)系(如多酚氧化酶、LOX活性等)及調(diào)控籽粒色澤有關(guān)基因的等位變異檢測及其在地方品種的分布規(guī)律的相關(guān)研究報道[16-20]，但迄今為止，對新疆冬小麥品種的POD基因TaPod-D1位點等位變異檢測以及兩個位點組合基因型檢測及分布規(guī)律的研究尚未見報道。本研究利用與POD活性相關(guān)的功能標(biāo)記POD-7D1和POD-7D6及POD-3A1和POD-3A2，對98份新疆冬小麥品種進(jìn)行分子標(biāo)記檢測及分布規(guī)律的研究，以期為改良新疆小麥面粉色澤、選育高POD活性品種及分子育種奠定理論和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及其來源

供試材料為98份新疆冬小麥品種(系)，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥課題組收集保存。其中，地方品種17份，引進(jìn)品種(系)38份，自育品種(系)43份，這些材料基本反映了不同時期新疆冬小麥的育種現(xiàn)狀。

1.2 基因組DNA的提取

為避免因種子混雜而造成錯誤的檢測結(jié)果，本研究中每個品種均取3粒大小均勻、籽粒飽滿具有較好代表性的種子，提取基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測

1.3.1 檢測引物

利用時 佳等[14]開發(fā)的顯性互補(bǔ)標(biāo)記POD-7D1和POD-7D6檢測小麥7D染色體上TaPod-D1基因的等位變異，利用魏景欣等[15]開發(fā)的顯性互補(bǔ)標(biāo)記POD-3A1和POD-3A2檢測小麥3A染色體上TaPod-A1基因的等位變異，具體見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 檢測POD基因的引物序列、擴(kuò)增片段長度及其等位變異Table 1 Primer sequences, amplified fragments, and corresponding allelic variations of POD gene

1.3.2 PCR擴(kuò)增與檢測

以小麥基因組DNA為模板，在Eppendorf AG PCR儀(Eppendorf，德國)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系參考2×Es Taq MasterMix(Dye)說明書配制，除標(biāo)記POD-3A2外，擴(kuò)增程序參考2×Es Taq MasterMix(Dye)說明書進(jìn)行，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為64 ℃(標(biāo)記POD-7D1)或62 ℃(標(biāo)記POD-7D6)或59 ℃(標(biāo)記POD-3A1)。標(biāo)記POD-3A2的擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，由68 ℃開始，每個循環(huán)退火溫度均降低0.3 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)每個小麥品種的三粒種子DNA檢測結(jié)果判斷該品種的POD基因TaPod-D1和TaPod-A1位點等位變異類型，選擇PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一且符合目標(biāo)條帶大小的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，若結(jié)果不一致，需重新提取該品種的其余籽粒DNA，進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆冬小麥品種(系)的 TaPod-D1和 TaPod-A1等位變異類型及分布頻率

用顯性互補(bǔ)功能標(biāo)記POD-7D1和POD-7D6及POD-3A1和POD-3A2對98份新疆冬小麥品種(系)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，結(jié)果(圖1、圖2和表2)表明，在TaPod-D1位點，98份新疆冬小麥品種(系)中，具有TaPod-D1b變異類型的材料有56份(占57.1%)，為優(yōu)勢等位變異；在TaPod-A1位點，具有TaPod-A1a變異類型的材料有70份(占71.4%)，為優(yōu)勢等位變異。也就是說，在兩個位點上，與高POD活性相關(guān)的變異類型(TaPOD-D1a和TaPOD-A1b)均為非優(yōu)勢等位變異。

在新疆地方小麥品種、自育小麥品種(系)以及引進(jìn)小麥品種(系)中，優(yōu)異等位變異類型TaPod-D1a和TaPod-A1b(與高POD活性相關(guān))的分布頻率均低于TaPod-D1b和TaPod-A1a變異類型，但TaPod-D1a變異類型在地方品種、自育品種(系)和引進(jìn)品種(系)中是漸次升高的，TaPod-A1b變異類型在地方品種、自育品種(系)和引進(jìn)品種(系)中也有漸次升高的趨勢。

a：用標(biāo)記POD-7D1擴(kuò)增的結(jié)果；b：用標(biāo)記POD-7D6擴(kuò)增的結(jié)果；M：Marker DL2000；1：邯5316；2：紅直頭/10；3：奎冬4號；4：新冬29號；5：新冬31號；6：唐山6898；7：奎花2號；8：石冬7號；9：新冬14號；10：奎花1號；11：伊農(nóng)20；12：新冬23號。

a：用標(biāo)記POD-3A1擴(kuò)增的結(jié)果；b：用標(biāo)記POD-3A2擴(kuò)增的結(jié)果；M：Marker DL2000；1：濟(jì)南4號；2：F49-70；3：小鵝186；4：新冬20號；5：新冬24號；6：碧瑪1號；7：碧瑪2號；8：工農(nóng)19；9：新冬21號；10：新冬22號。

表2 新疆冬小麥品種(系)中TaPod-D1和TaPod-A1位點等位基因的分布頻率Table 2 Frequencies of TaPod-D1 and TaPod-A1 in different types of winter wheat varieties

2.2 新疆冬小麥品種(系)的 TaPod-D1和 TaPod-A1等位變異組合類型及分布頻率

檢測結(jié)果(表3)表明，在98份新疆冬小麥材料中共出現(xiàn)4種等位變異組合，分別為TaPod-D1a/TaPod-A1a、TaPod-D1a/TaPod-A1b、TaPod-D1b/TaPod-A1a和TaPod-D1b/TaPod-A1b。

在地方品種和自育品種(系)中，優(yōu)勢組合類型均為TaPod-D1b/TaPod-A1a，具有優(yōu)異組合TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種數(shù)均最少。在引進(jìn)品種(系)中，優(yōu)勢組合類型為TaPod-D1a/TaPod-A1a，具有優(yōu)異組合類型TaPod-D1a/TaPod-A1b的品種數(shù)也最少。但優(yōu)異組合類型TaPod-D1a/TaPod-A1b在地方品種、自育品種(系)和引進(jìn)品種(系)中有漸次升高的趨勢。

在11份具有TaPod-D1a/TaPod-A1b等位變異組合的材料中，6個為自育品種(新冬14號、新冬24號、新冬27號、新冬33號、伊農(nóng)21和新冬2號)，4個為引進(jìn)品種(F49-70、阿芙樂爾、洛夫林18號和小鵝186)，1個為地方品種(麥洛瓦西)。這些品種可以作為高活性POD的優(yōu)良種質(zhì)。

表3 新疆冬小麥品種(系)中TaPod-D1和TaPod-A1位點等位變異基因組合類型的分布頻率Table 3 Frequencies of different allelelic combination on TaPod-D1 and TaPod-A1 gene loci in different types of winter wheat

3 討 論

時 佳等[14]利用TaPod-D1位點的顯性互補(bǔ)標(biāo)記POD-7D1與POD-7D6檢測243份中國小麥材料，結(jié)果表明TaPod-D1a基因型所占比例較低。魏景欣等[15]、耿洪偉等[19]利用TaPod-A1位點的POD-3A1和POD-3A2功能標(biāo)記檢測不同小麥材料，結(jié)果顯示TaPod-A1b基因型所占比例較低。本研究利用兩對功能標(biāo)記POD-7D1和POD-7D6與POD-3A1和POD-3A2對98份新疆冬小麥品種(系)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明各位點的等位變異類型的分布與前人的研究結(jié)果基本一致，優(yōu)異等位變異TaPod-D1a和TaPod-A1b類型的分布頻率也較低，這可能與新疆乃至全國的育種家在選育優(yōu)質(zhì)品種時以面筋強(qiáng)度為主要依據(jù)，對酶的特性考慮較少有關(guān)；新疆地方小麥品種中的TaPod-D1a和TaPod-A1b的分布頻率均為最低，可能與新疆早期育種對面粉及面制品顏色相關(guān)的性狀研究起步較晚，沒有施加足夠的選擇壓力，同時又缺乏對品種(系)POD基因型的認(rèn)識相關(guān)。而新疆自育品種(系)中TaPod-D1a和TaPod-A1b的分布頻率介于新疆地方品種和全國品種之間，表明新疆早期小麥育種受地方品種的影響較大，導(dǎo)致高POD活性的TaPod-D1a和TaPod-A1b變異類型較少，近年來隨著外引力度加大，使得新疆冬小麥優(yōu)異等位變異TaPod-D1a/TaPod-A1b得到提升。這一結(jié)果與新疆冬小麥早期品種多以地方品種為親本育成，近期品種則多以自育品種(系)和外引品種為親本所育的現(xiàn)狀相符。表明外來種質(zhì)的引進(jìn)改變了新疆小麥的遺傳組成，有力地推動了新疆小麥品質(zhì)的遺傳改良。

此外，本研究僅對新疆冬小麥材料中控制POD活性位點7D及3A的等位變異進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測，并未對其POD活性進(jìn)行測定和關(guān)聯(lián)驗證，雖然在一定程度上可通過品種的POD基因型反映新疆冬小麥相應(yīng)位點不同等位變異的分布和演化規(guī)律，但不能排除POD基因型相同而活性差異大的情況。今后，我們將進(jìn)一步對新疆冬小麥品種(系)的POD活性進(jìn)行測定，以期通過表型和基因型相結(jié)合對新疆小麥的POD活性進(jìn)行綜合評價，為新疆小麥面粉和面制品色澤遺傳改良奠定基礎(chǔ)。