李 蒙

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院， 陜西 西安 710065)

車(chē)前草(PlantagoasiaticaL.)屬于車(chē)前科多年草本植物，在自然界分布廣泛，主要生長(zhǎng)于山野或路旁等處，其種子和全草均可入藥，民間采集幼苗經(jīng)加工成美味而食用，能調(diào)節(jié)胃腸功能，具有解毒、清熱利尿、治療痰熱咳喘等功效[1-2]。

蛋白質(zhì)資源緊缺成為世界性問(wèn)題，由于我國(guó)人口眾多，資源缺乏尤為嚴(yán)重，幾乎每年都進(jìn)口大量的蛋白質(zhì)飼料原料，因此，蛋白質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義[3]。具有藥食兩用的車(chē)前草是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的植物蛋白質(zhì)資源，目前關(guān)于蛋白質(zhì)提取方法有很多[4]，不同植物中各種成分的差異，故采取不同的提取方法，而從車(chē)前草中提取蛋白的方法至今鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究由必要對(duì)車(chē)前草葉片的蛋白質(zhì)的提取方法進(jìn)行探索，以期為今后車(chē)前草蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

前草種子(采摘于陜西省商洛市商州區(qū)黑龍口鎮(zhèn)山野車(chē))，種植于西安文理學(xué)院植物繁育單元溫室中，四十天后，采摘新鮮車(chē)前草葉片洗凈晾干后，研成粉末，作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

試劑：三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)，氯化鈉(分析純)，考馬斯亮藍(lán)G250( 超純，Amresco)等實(shí)驗(yàn)所用分析純?cè)噭?/p>

儀器： 紫外·可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)：UV-2450，島津公司)，全自動(dòng)鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：ZFD-5250A，陜西天美)，電子天平(型號(hào)：BSA223S，上海智泰電子科技)，恒溫水浴鍋(型號(hào)：HH-S，北京科偉)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：H1850R，湘儀)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取方法 堿、鹽、Tris-HCl提取方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取約1 g實(shí)驗(yàn)材料，按表1和表2進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)浸提時(shí)間、浸提溫度，離心去除殘?jiān)?，上清用紗布過(guò)濾，然后用2 mol·L-1的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH(Tris-HCl提取：加入飽和硫酸銨充分?jǐn)嚢? h)有大量沉淀，再12 000 r·min-1離心10 min，再透析得到粗蛋白，再50～60 ℃下烘干至恒重。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

表2 不同方法測(cè)定因素與水平

1.3.2 測(cè)定蛋白質(zhì)含量 根據(jù)文獻(xiàn)[5]Bradford法，以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為6%)，加入G-250試劑，在波長(zhǎng)595 nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

計(jì)算方法：蛋白質(zhì)得率(%)=(粗蛋白提取質(zhì)量/稱(chēng)取葉片樣品質(zhì)量)×100%。運(yùn)用Excel數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿法提取蛋白結(jié)果分析

從表3正交試驗(yàn)分析可知，四種因素影響蛋白提取效果為B>D>C>A，堿提取車(chē)前草蛋白質(zhì)最佳工藝為A3B1C2D2，即堿液濃度為1.5 %，浸提溫度為60 ℃，抽提60 min，固液體積比1∶ 10。

2.2 鹽法提取蛋白結(jié)果分析

從表4正交試驗(yàn)分析可知，四種因素影響蛋白提取效果為A>B>D>C，鹽提取車(chē)前草蛋白質(zhì)最佳工藝為A3B1C2D1，即鹽濃度為1.5 %，浸提溫度為60 ℃，抽提時(shí)間為60 min，固液體積比為1∶ 5。

2.3 Tris-HCl法提取蛋白結(jié)果分析

從表5正交試驗(yàn)分析可知，四種因素影響蛋白提取效果為B>A>D>C，Tris-HCl提取車(chē)前草蛋白質(zhì)最佳工藝為A3B1C3D3，即Tris-HCl緩沖液pH值為8.0，浸提溫度為20 ℃，抽提時(shí)間為90 min，固液體積比為1:15。

表3 堿法的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 鹽法的正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 Tris-HCl法的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

研究不同方法對(duì)車(chē)前草葉片蛋白的提取效果，及其工藝條件的優(yōu)化，篩選每種提取方法的最佳條件。結(jié)果表明，堿提取車(chē)前草葉片蛋白的效果要優(yōu)于鹽提取法、Tris-HCl提取法。關(guān)于車(chē)前草蛋白質(zhì)的提取鮮見(jiàn)報(bào)道，此研究有助于車(chē)前草蛋白資源的研究與開(kāi)發(fā)。

統(tǒng)計(jì)顯示，世界上有2/3的人缺乏蛋白質(zhì)，尋找蛋白質(zhì)資源對(duì)未來(lái)糧食的補(bǔ)充及畜牧業(yè)的飼用蛋白的彌補(bǔ)，具有重要意義[6-7]。本結(jié)果所得蛋白得率不高，可能原因是車(chē)前草中含有大量的多糖類(lèi)物質(zhì)[8]，影響提取效果，還有在提蛋白過(guò)程中，組織中的蛋白酶活性較高，直接將蛋白質(zhì)水解，Tris-HCl緩沖液為蛋白酶活性提供了合適的反應(yīng)體系，或者實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其它影響因素，如原料的破碎程度、雜質(zhì)等，因此，提取車(chē)前草蛋白還有待進(jìn)一步深入研究。