趙一鶴，李 沁，夏 菁，施 蕊，陳 薇，鄒 潔，張靜美

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明 650021；2.西南林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，云南昆明 650024；3.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650021)

辣木(Moringaoleifera)又稱(chēng)為鼓槌樹(shù)(drumstick tree)，因其具有辛辣味的根而得名[1-2]，是辣木亞目(Moringineae)辣木科(Moringaceae)辣木屬(MoringaAdans.)植物的統(tǒng)稱(chēng)[3-4]，原產(chǎn)于熱帶及南亞熱帶的干旱或半干旱區(qū)域，在我國(guó)未見(jiàn)自然分布，目前我國(guó)已將其作為經(jīng)濟(jì)型植物引進(jìn)種植。

自由基是一類(lèi)具有不成對(duì)電子的原子和基團(tuán)，是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有強(qiáng)的氧化性，可損害機(jī)體組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性毒性和細(xì)胞衰亡作用，存在于植物和動(dòng)物細(xì)胞中，是生命體細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要誘因。體內(nèi)活性氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基等，本身具有一定的功能，但過(guò)多的活性氧自由基就會(huì)有破壞行為，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織損壞，從而引起多種疾病，如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤。外界誘因會(huì)使人體產(chǎn)生更多活性氧自由基，使核酸突變，這是人類(lèi)衰老和患病的根源。因此，抗氧化作用成為人們維護(hù)健康所關(guān)注的熱點(diǎn)，各類(lèi)抗氧化劑和抗氧化保健日化品成為熱銷(xiāo)產(chǎn)品。

Sholapur等[5]研究結(jié)果表明，辣木能夠抑制周緣組織內(nèi)由地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抗性。Jaiswal等[6]通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)辣木葉片具有顯著的抗氧化活性，能保護(hù)正常人及糖尿病患者免受氧化脅迫的損傷。辣木籽油因含辣木多糖，具有一定的抗氧化活性，辣木葉抗氧化活性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)引進(jìn)時(shí)間較短，目前對(duì)辣木的研究主要集中在引種栽培[7-8]、營(yíng)養(yǎng)成分[9-10]以及辣木油的提取工藝[11-12]等方面，關(guān)于辣木生物活性的研究較少[13-14]。筆者對(duì)辣木葉乙醇初提物用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取，得到辣木葉石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，采用DPPH(二苯代苦味酰基)和鄰苯三酚自氧化法對(duì)辣木葉的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)不同的抗氧化活性測(cè)定，明確辣木葉中具有抗氧化活性的萃取物部分，以期為辣木葉中具有抗氧化活性的化合物的進(jìn)一步分離奠定基礎(chǔ)，也為辣木葉開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑或天然日化產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1辣木葉辣木鮮葉樣品采自云南省大理州賓川縣，將其陰干，備用。

1.2儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、UV-紫外分光光度計(jì)、循環(huán)水式多用真空泵、電爐、電子天平、移液管、移液槍、膠頭滴管、試管、培養(yǎng)皿、鑷子。

1.3試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、蒸餾水、DPPH、無(wú)水乙醇、抗壞血酸。

1.4原材料處理將辣木葉用75%的乙醇冷浸3次，合并3次濾液，于55 ℃下旋蒸濃縮，再依次用等體積石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯對(duì)所得浸膏進(jìn)行萃取，要求每種試劑都萃取3次，以達(dá)到萃取層基本無(wú)雜色。合并每種溶劑所得萃取液，減壓濃縮至干。萃取結(jié)束后，得到3層濃縮浸膏，即石油醚層浸膏、二氯甲烷層浸膏及乙酸乙酯層浸膏。

1.5抗氧化活性測(cè)定

1.5.1溶液的配制。

1.5.1.1DPPH抗氧化法。精密稱(chēng)取辣木各提取層0.1 g，用95%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶，搖勻，超聲20 min，作為母液。精密稱(chēng)取2 mg DPPH，加無(wú)水乙醇40 mL，超聲5 min。用分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)得吸光度，由此來(lái)計(jì)算抗氧化能力。

1.5.1.2鄰苯三酚自氧化法。樣品溶液：精密稱(chēng)取0.300 g樣品，加10 mL緩沖液，備用。0.1 mol/L Tris：精密稱(chēng)取1.21 g Tris，0.037 2 g EDTA，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中；0.1 mol/L HCl：0.85 mL 36%HCl溶液，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中；pH 8.2 Tris-HCl緩沖液：50 mL 0.1 mol/L Tris，22.9 mL 0.1 mol/L HCl蒸餾水定容于100 mL蒸餾水；10 mmol/L鄰苯三酚：精密稱(chēng)取0.630 6 g鄰苯三酚定容于100 mL容量瓶中。

1.5.2DPPH抗氧化法測(cè)定。按表1分別取2 mL不同濃度(100、200、300、400、500 μg/mL)樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻。室溫放置30 min后于517 nm處測(cè)吸光值，用抗壞血酸(VC)作為陽(yáng)性對(duì)照。

表1 DPPH法試劑加入量

計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率= [1-(A1-A3)/A2]×100%

式中，A1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；A2為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光值；A3為2 mL樣品溶液+2 mL 無(wú)水乙醇的吸光值。

1.5.3鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL，置于25 ℃水浴中保溫20 min，按表2依次加入不同濃度(200、400、600、800、1 000 μg/mL)樣品溶液、鄰苯三酚溶液和蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，每30 s在325 nm處測(cè)定吸光值。

表2 鄰苯三酚法試劑加入量

計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子自由基(O2·-)的抑制率：

鄰苯三酚自氧化率=(第4分鐘的OD325-第1分鐘的OD325)/3

抑制率=(鄰苯三酚自氧化率-加樣后鄰苯三酚自氧化率)/鄰苯三酚自氧化率× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1辣木葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用從圖1可以看出，辣木葉石油醚層具有抗氧化活性，并且隨著樣品濃度的增大，辣木葉石油醚層對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，在樣品濃度為500 μg/mL時(shí)趨于平緩，清除率達(dá)86.07%；辣木葉二氯甲烷層對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大逐漸增強(qiáng)，在濃度為300 μg/mL時(shí)趨于平緩，清除率達(dá)89.32%；辣木葉乙酸乙酯層對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。在濃度為200 μg/mL時(shí)趨于平緩，清除率達(dá)92.06%。

辣木提取物的石油醚層、二氯甲烷層和乙酸乙酯層都對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用。同時(shí)，乙酸乙酯層清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于二氯甲烷層，而二氯甲烷層的清除能力強(qiáng)于石油醚層。并且在相同濃度梯度下，辣木葉各個(gè)提取層清除DPPH自由基的能力低于陽(yáng)性對(duì)照組VC。

圖1 辣木葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on DPPH radical

2.2辣木葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用由圖2可知，辣木葉石油醚層提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率較低，在樣品濃度達(dá)1 000 μg/mL時(shí)為19.31%，而二氯甲烷層提取物在樣品濃度為800 μg/mL時(shí)清除率為24.81%，相對(duì)乙酸乙酯層對(duì)超氧陰離子自由基的清除率較低。相同條件下，乙酸乙酯層提取物在濃度為400 μg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)36.10%，和其他提取物相比，其抗氧化作用較強(qiáng)，雖然和陽(yáng)性對(duì)照物VC相比，對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率還是較低，但該試驗(yàn)采用的材料是辣木葉提取物而不是單體，而VC為單體化合物，因此下一步將考慮把辣木葉乙酸乙酯層進(jìn)行分離純化，獲得活性單體化合物再進(jìn)行抗氧化活性研究。

辣木葉提取物的石油醚層、二氯甲烷層和乙酸乙酯層都對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用。同時(shí)，乙酸乙酯層對(duì)超氧陰離子自由基的抑制能力強(qiáng)于二氯甲烷層，而二氯甲烷層的抑制能力強(qiáng)于石油醚層。在相同濃度梯度下，辣木葉各個(gè)提取層對(duì)超氧陰離子自由基的抑制能力均低于陽(yáng)性對(duì)照組VC。

圖2 辣木葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on superoxide anion radical

3 結(jié)論與討論

該研究對(duì)辣木葉乙醇初提物用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取[15-16]，得到辣木葉石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，并同時(shí)進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。植物抗氧化測(cè)定方法主要集中在脂質(zhì)體過(guò)氧化、自由基清除率和抗過(guò)氧化物歧化酶等方面，其中DPPH法是最常用的抗氧化測(cè)定方法，DPPH法是基于DPPH有機(jī)溶劑在520 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，如抗氧化劑同時(shí)存在時(shí)與其孤對(duì)電子配對(duì)而吸收減弱的原理檢測(cè)抗氧化劑對(duì)自由基的清除效率，是評(píng)價(jià)抗氧化劑最常用的方法。鄰苯三酚法則屬于抗過(guò)氧化物歧化酶活性測(cè)定范圍，利用鄰苯三酚在自氧化過(guò)程中產(chǎn)生有色中間體和超氧陰離子，利用SOD分解而間接推算酶活力的方法。該研究通過(guò)比較不同的抗氧化活性，明確辣木葉中的抗氧化活性部位，通過(guò)2種抗氧化方法的比較，確定辣木葉提取物中乙酸乙酯提取物的抗氧化作用主要為對(duì)自由基的清除作用，為下一步開(kāi)發(fā)辣木葉天然抗氧劑提供了理論基礎(chǔ)[16]。

在抗氧化試驗(yàn)中，測(cè)定辣木葉石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯3個(gè)提取層的DPPH自由基清除作用，3個(gè)提取層均有清除作用，且隨濃度的增大而增大，同時(shí)在相等的濃度條件下，乙酸乙酯層抗氧化效果最強(qiáng)，其次是二氯甲烷層，再次是石油醚層。植物的抗氧化能力多與其多酚類(lèi)物質(zhì)和黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量有一定的關(guān)系，乙酸乙酯層比其他2層抗氧化效果好可能是由于其主要萃取植物中黃酮和多酚成分。雖然各提取層清除DPPH自由基的能力均低于VC，但是在濃度為500 μg/mL以上時(shí)，各層對(duì)DPPH自由基清除率都為90%左右。

由此可見(jiàn)，辣木葉具有良好的抗氧化性，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。抗氧化劑是食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域常用和必須使用的輔料和添加劑。化學(xué)合成抗氧化劑對(duì)身體有一定的毒性和致突變作用，隨著消費(fèi)者對(duì)天然健康的需求日益加強(qiáng)，天然抗氧化劑將是未來(lái)抗氧化劑研究和開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。辣木葉是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的天然抗氧化劑，其在2012年被列入國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品目錄，使得辣木葉的綜合開(kāi)發(fā)利用成為可能，作為食品級(jí)原料，其安全性已經(jīng)得到認(rèn)可，如能在此基礎(chǔ)上對(duì)其功能性進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，將擴(kuò)大辣木葉的價(jià)值和利用范圍。辣木葉作為一種新型抗氧化劑或抗衰老保健品，也可以對(duì)其單體化合物的抗氧化功能做進(jìn)一步研究，以期開(kāi)發(fā)出相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品。