徐勝威，楊 程，斯烈鋼，申屠基康，沈偉良

(寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315000)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱(chēng)南美白對(duì)蝦，隸屬甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對(duì)蝦科(Penaeidae)對(duì)蝦屬(Penaeus)，主要分布于太平洋海岸水域[1]。由于其肌肉成分中脂肪含量低，蛋白含量高，并富含多種飽和脂肪酸，使其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。凡納濱對(duì)蝦因其生長(zhǎng)周期短，抗逆性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高，成為全球養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一，并于20世紀(jì)80年代末引入我國(guó)，經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，其養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大，技術(shù)不斷更新，目前已成為我國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖面積最大的品種之一[2]。然而，由于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益顯著，集約化養(yǎng)殖模式發(fā)展迅速，養(yǎng)殖密度逐漸提高，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重，其中氨氮作為重要的水質(zhì)因子已成為影響水產(chǎn)養(yǎng)殖品種健康生長(zhǎng)的主要因素之一。研究表明，在一定濃度的氨氮脅迫下水產(chǎn)病害極易發(fā)生和流行[3]。蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)屬于真菌界(Fungi)微孢子蟲(chóng)門(mén)(Microsporidia)單倍期綱(Haplophasea)壺孢目(Chytridiopsida)腸胞蟲(chóng)科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲(chóng)屬(Enterocytozoon)[4-5]，屬于細(xì)胞內(nèi)寄生[6-7]，是目前影響對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要疾病之一，最早于2009年在泰國(guó)發(fā)現(xiàn)，2013年我國(guó)第一次在養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦中檢測(cè)出EHP，并有很高的感染率[8]。運(yùn)用PCR檢測(cè)技術(shù)可以從感染EHP的凡納濱對(duì)蝦的水環(huán)境、排泄物及肝胰腺等器官中檢測(cè)出EHP[9-11]，其鰓、血淋巴、腸、心臟、肌肉組織也均可檢測(cè)到EHP[12-13]，但不同組織中EHP的含量差異及它們間的相互關(guān)系還不明確。感染后的對(duì)蝦仍可以繼續(xù)存活和進(jìn)食，但會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)現(xiàn)象，需要得到足夠重視，否則病原的大規(guī)模擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖戶浪費(fèi)過(guò)多的飼料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14-16]。

由于EHP的特殊存在方式，目前還沒(méi)有明確的治療藥物，所以在養(yǎng)殖過(guò)程中注意容易感染的環(huán)節(jié)，通過(guò)改善水體，輔助一些維生素、中草藥成分，可以起到一定的預(yù)防效果[17]。目前關(guān)于研究主要集中在氨氮對(duì)對(duì)蝦的急性毒性方面的研究[18-19]，關(guān)于EHP對(duì)對(duì)蝦的的生長(zhǎng)狀況的研究較少[20-21]，而關(guān)于氨氮與EHP之間的關(guān)系研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者研究了不同濃度氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)和體重的影響，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析氨氮脅迫對(duì)其EHP攜帶量的影響，以期為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)用蝦取自寧波市海洋與漁業(yè)科技創(chuàng)新基地，選取肢體完整、體格相近的凡納濱對(duì)蝦為試驗(yàn)蝦，體長(zhǎng)(4.0±0.5) cm，體重(0.38±0.02)g。試驗(yàn)開(kāi)始前，將凡納濱對(duì)蝦撈出分別放入9個(gè)試驗(yàn)容器(600 L圓桶，300尾/桶)中暫養(yǎng)7 d，每天投喂4次(06：00、11：00、16：00、21：00)，餌料適量(以2 h內(nèi)吃凈為準(zhǔn))。隨著凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，飼料由0號(hào)料變?yōu)?號(hào)料，餌料量隨之增加，投食改為每天3次(06：00、13：00、20：00)，每2 d換水1次，換水量為總體積的10%。

1.1.2試劑。DNA提取試劑盒(Tissue DNA Kit)購(gòu)自O(shè)mega公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國(guó))；氯化銨為分析純?cè)噭?上海生工)。

1.1.3試驗(yàn)用水。用經(jīng)沙過(guò)濾處理的海水作為試驗(yàn)用水，鹽度(24±1)‰，水溫(25±1)℃，pH為(8.0±0.2)，氨氮濃度為0.1 mg/ L，亞硝酸氮濃度為0.003 mg/ L，溶解氧含量為(6.5±0.5)mg/ L，水質(zhì)符合 NY 5052—2001無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部2001)的要求；在試驗(yàn)用基礎(chǔ)水中添加適量的NH4Cl母液，調(diào)配成不同濃度的NH4Cl試驗(yàn)水。

1.2方法參考大量文獻(xiàn)并經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)置0.1 mg/L(空白組)、6.0 mg/L(試驗(yàn)組Ⅰ)、9.0 mg/L(試驗(yàn)組Ⅱ)3個(gè)氨氮濃度組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行投放試驗(yàn)對(duì)蝦300尾，試驗(yàn)期為30 d，試驗(yàn)期間每天投料4次，每天監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水體氨氮濃度，并用NH4Cl母液穩(wěn)定試驗(yàn)所需的氨氮濃度。

1.2.1對(duì)蝦體長(zhǎng)和體重的測(cè)定。將試驗(yàn)對(duì)蝦投放試驗(yàn)容器前，隨機(jī)選取100尾對(duì)蝦進(jìn)行體長(zhǎng)和體重的測(cè)定，并統(tǒng)計(jì)大蝦(體長(zhǎng)>4.5 cm)、中蝦(體長(zhǎng)4.0～4.5 cm)及小蝦(體長(zhǎng)<4.0 cm)所占的比例，再取肝胰腺置于無(wú)水乙醇中-80 ℃下保存，備用；然后，每隔10 d從每個(gè)平行組中隨機(jī)取30尾凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行體長(zhǎng)和體重的測(cè)定，并取肝胰腺置于無(wú)水乙醇中-80 ℃下保存，備用；每次采樣結(jié)束后，記錄每個(gè)組存活的蝦數(shù)目，計(jì)算不同氨氮濃度下凡納濱對(duì)蝦的EHP感染率和存活率；第4次采樣后，每組隨機(jī)取100尾蝦測(cè)量體長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)大蝦、中蝦及小蝦所占的比例。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦的EHP攜帶量。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取感染EHP的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺提取的總DNA為模板，用定量用特異引物(引物EHP-F為5′-GACCAACGGAGGCGAAAGCG-3′，EHP-R為5′-CAACGGCCATGCACCACTCTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的目的片段連接、轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，使用核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop ND-2000，Thermo)測(cè)定所提質(zhì)粒的濃度，將所測(cè)濃度的質(zhì)粒按10倍梯度稀釋成13管，并采用實(shí)時(shí)定量PCR，以含有EHP基因片段的質(zhì)粒濃度梯度所對(duì)應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒濃度的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2實(shí)時(shí)定量PCR。采用三步法在ABI 7500上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，具體操作參照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國(guó))試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)體系(20 μL)如下：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L EHP-F 1 μL、10 μmol/L EHP-R 1 μL、模板1 μL、ddH2O 7 μL。

將不同樣品中EHP基因的表達(dá)量所對(duì)應(yīng)的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)照，即可得到該樣品目的基因表達(dá)量的相對(duì)濃度值，最后根據(jù)含目的基因的質(zhì)粒分子量，計(jì)算出樣品的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1EHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線將含有EHP的質(zhì)粒原液經(jīng)10倍梯度稀釋后作為模板，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。以含有EHP基因片段的質(zhì)粒濃度梯度所對(duì)應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒濃度的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖1可以看出，線性回歸方程R2為0.998 2，線性較好，且經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定樣品濃度在曲線區(qū)間內(nèi)。

2.2不同濃度氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率和感染率的影響由圖2可知，0～10 d各組EHP感染率上升幅度較大，10～30 d趨于平穩(wěn)；空白組先于試驗(yàn)組達(dá)到100%感染率，氨氮濃度越低，EHP感染率越早達(dá)到峰值，表明氨氮對(duì)EHP影響有一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)。

圖1 EHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of EHP

圖2 氨氮腔迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦EHP感染率的影響Fig.2 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP infection rate of L.vannamei

由圖3可知，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組凡納濱對(duì)蝦的存活率從大到小依次為試驗(yàn)組Ⅱ、空白組、試驗(yàn)組Ⅰ，表明試驗(yàn)組Ⅱ凡納濱對(duì)蝦的健康狀況優(yōu)于試驗(yàn)組Ⅰ和空白組。

圖3 氨氮脅迫對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦存活率的影響Fig.3 Effects of ammonia nitrogen stress on survival rate of L.vannamei infected with EHP

2.3不同濃度氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)和體重的影響從圖4可以看出，各組凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(shì)，表明9.0 mg/L氨氮對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)增長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

從圖5可以看出，各組凡納濱對(duì)蝦的體重變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(shì)，表明9.0 mg/L氨氮對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦的體重增長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

圖4 氨氮脅迫對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of ammonia nitrogen stress on body length of L.vannamei infected with EHP

圖5 氨氮脅迫對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦體重的影響Fig.5 Effects of ammonia nitrogen stress on body weight of L.vannamei infected with EHP

由表1可知，試驗(yàn)結(jié)束后，空白組大蝦增長(zhǎng)率為9.17%，試驗(yàn)組Ⅰ的大蝦增長(zhǎng)率為19.29%，試驗(yàn)組Ⅱ的大蝦增長(zhǎng)率最高(22.65%)，且小蝦所占的比例下降明顯。

表1 0 d和30 d各組不同大小凡納濱對(duì)蝦所占比例

2.4不同濃度氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦EHP攜帶量的影響從圖6可以看出，各組EHP攜帶量的變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢(shì)，0～10 d 3組EHP攜帶量差異不大，10～30 d空白組EHP攜帶量最高，表明試驗(yàn)組Ⅱ抑制EHP表達(dá)的效果優(yōu)于空白組和試驗(yàn)組Ⅰ。

3 討論

在養(yǎng)殖水體中，氨氮作為重要的水質(zhì)因子之一，主要以NH3和NH4+2種形式存在，其中NH3對(duì)水生動(dòng)物的損傷最嚴(yán)重，NH3不帶電荷可以穿透水生動(dòng)物體表進(jìn)入體內(nèi)，破壞水生動(dòng)物的生理機(jī)能，能夠?qū)ζ浣M織器官造成損傷，引發(fā)甲殼動(dòng)物急性中毒癥狀，對(duì)水生動(dòng)物的健康生長(zhǎng)有著重要的影響[22-25]。肝胰腺作為重要的新陳代謝和解毒器官，是對(duì)蝦在氨氮脅迫下表現(xiàn)最敏感的器官[26]。研究表明，氨氮脅迫會(huì)降低蝦類(lèi)的免疫力，增加對(duì)病原體的感染率[27-28]。

圖6 氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦EHP攜帶量的影響Fig.6 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP carrying capacity of L.vannamei

EHP作為對(duì)蝦養(yǎng)殖中重要的病原之一，主要侵染對(duì)蝦的肝胰腺和腸道，能夠從宿主細(xì)胞獲得能量，影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育。該試驗(yàn)研究了不同濃度氨氮脅迫對(duì)感染EHP凡納濱對(duì)蝦體重和體長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明試驗(yàn)組Ⅱ凡納濱對(duì)蝦體重和體長(zhǎng)的增長(zhǎng)情況優(yōu)于試驗(yàn)組Ⅰ和空白組，而試驗(yàn)組Ⅱ凡納濱對(duì)蝦的EHP攜帶量最少。研究表明，EHP的攜帶量與對(duì)蝦的體重和體長(zhǎng)等指標(biāo)有一定的相關(guān)性，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性[29-30]；氨氮脅迫影響蝦類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育，而肝胰腺是受到損害最主要的器官[31]，與EHP侵染的是同一器官。由于EHP進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有合成ATP 的功能[32]，所以其生長(zhǎng)繁殖和能量代謝只能利用宿主細(xì)胞的ATP，從而影響宿主的能量代謝[33]。氨氮損傷肝胰腺引起其合成ATP功能減弱，EHP在肝胰腺細(xì)胞中得不到足夠的能量，從而抑制自身的生長(zhǎng)甚至死亡，導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦EHP攜帶量減少，延緩EHP的感染率以及提高對(duì)蝦的存活率。該試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)氨氮濃度為9.0 mg/L時(shí)，凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于其他2組，EHP攜帶量少于其他2組，個(gè)體較大的凡納濱對(duì)蝦 EHP 攜帶量明顯低于較小的個(gè)體[33]，EHP感染率及存活率也低于其他2組，空白組和試驗(yàn)組Ⅰ除了存活率有明顯差異外，其他指標(biāo)均無(wú)明顯差異。這說(shuō)明氨氮在一定濃度范圍內(nèi)可以有效控制EHP的攜帶量，即當(dāng)養(yǎng)殖水體氨氮濃度為6.0～9.0 mg/L時(shí)，可以有效減少凡納濱對(duì)蝦EHP 的攜帶量，從而為對(duì)凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖提供重要的指導(dǎo)意義。