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(李錦記(新會(huì))食品有限公司，廣東 江門 529156)

醬油在發(fā)酵過程中,淀粉質(zhì)原料被分解產(chǎn)生還原糖,還原糖不僅有助于醬油生色,而且可以被酵母利用生成醇、酸、酯等香氣成分[1],特別是還原糖含量與醬油風(fēng)味物質(zhì)的生成密切相關(guān)。因此,還原糖含量對(duì)于醬油的色、香、味都有較大影響,是醬油釀造過程中的一項(xiàng)重要參數(shù)。

醬油中還原糖含量的傳統(tǒng)測(cè)定方法是依據(jù)GB 5009.7-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》， 該方法中的直接滴定法，其滴定條件需要人工控制，且反應(yīng)熱源、滴定速度、滴定體積等因素控制對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響很大。還需人手在高功率電爐上準(zhǔn)確操作，有一定的技術(shù)難度和勞動(dòng)強(qiáng)度，滴定終點(diǎn)靠人的肉眼來判斷，誤差大[2]。而應(yīng)用電位滴定技術(shù)自動(dòng)檢測(cè)還原糖的方法，在葡萄酒和飲料中已有相關(guān)研究[3-5]。

原理：在試劑除去蛋白質(zhì)的干擾后，將一定量的斐林試劑甲、乙液混合后，生成天藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，沉淀很快與酒石酸鉀鈉反應(yīng)，生成深藍(lán)色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物，在加熱的條件下，以亞甲基藍(lán)作為指示劑，用0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，還原糖的醛基作為還原部位與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，生成紅色的氧化亞銅沉淀，待二價(jià)銅全部被還原后，稍過量的還原糖將亞甲基藍(lán)還原為其隱色體，溶液的藍(lán)色消失，即為滴定終點(diǎn)。本文采用自動(dòng)滴定儀、復(fù)合Pt環(huán)電極、氧化還原滴定法，應(yīng)用能斯特方程電位突躍指示法自動(dòng)識(shí)別滴定終點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵醬油：李錦記(新會(huì))食品有限公司。

硫酸銅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取在101 ℃ 烘2～3 h至恒重的分析純無水葡萄糖1.000 g，放入100 mL燒杯中，用蒸餾水定容至1 L，為防染菌，可加5 mL濃鹽酸。

1.2 儀器與設(shè)備

905自動(dòng)電位滴定儀、復(fù)合Pt環(huán)電極 瑞士萬通(中國)有限公司；C-MAG HS7 Control加熱攪拌器 德國IKA集團(tuán)；天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 參數(shù)設(shè)定調(diào)試

選取有RS 232接口的加熱攪拌器，接入電腦，采用905自動(dòng)電位滴定儀、復(fù)合Pt金屬環(huán)電極、智能滴定軟件Tiamo，參照國標(biāo)GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》方法，設(shè)定滴定程序和參數(shù)，再進(jìn)行多次樣品測(cè)試，對(duì)反應(yīng)過程的各關(guān)鍵影響參數(shù)(加熱面板溫度、攪拌速度、終點(diǎn)電位評(píng)估等)逐一進(jìn)行研究優(yōu)化。

試樣正式滴定：待電爐預(yù)熱溫度至430 ℃左右， 向小燒杯中加入斐林甲液、乙液各5 mL，加入1 mL稀釋樣品，放在電爐中央，選擇方法“正式滴定”，點(diǎn)擊“開始”， 在“Sample Size”欄輸入預(yù)加葡萄糖的mL數(shù)(約比預(yù)備滴定少1 mL)，點(diǎn)“繼續(xù)”進(jìn)行預(yù)加體積，待液體沸騰時(shí)，點(diǎn)“繼續(xù)”， 將滴定管和電極小心放進(jìn)液體里， 軟件自動(dòng)開始計(jì)時(shí)沸騰30 s，然后開始等量MET滴定，待滴定終點(diǎn)出現(xiàn)后，滴定停止，自動(dòng)計(jì)算結(jié)果并寫入設(shè)備。

1.3.2 精密度測(cè)試

選取3個(gè)不同的醬油樣品，應(yīng)用以上經(jīng)調(diào)試后的滴定程序參數(shù)，進(jìn)行自動(dòng)電位法滴定醬油中還原糖的含量。每個(gè)樣品分別平行測(cè)定5次，分析結(jié)果。

1.3.3 加標(biāo)回收率測(cè)試

準(zhǔn)確稱量0.500,1.000,2.000,5.000 g葡萄糖標(biāo)樣，分別加入4份100 mL的醬油b樣品中，應(yīng)用以上方法滴定，測(cè)定加標(biāo)前、加標(biāo)后樣品的還原糖含量。每個(gè)樣品分別平行測(cè)定3次，分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量檢測(cè)的程序參數(shù)

2.1.1 加熱溫度對(duì)結(jié)果的影響

反應(yīng)液的溫度與溶解氧的含量有直接的關(guān)系。溫度越高，溶解氧含量越低。滴定時(shí)要保持沸騰狀態(tài)，使上升的蒸汽阻止空氣侵入反應(yīng)體系中。因此溫度的變化對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大的影響[6-9]。按以上滴定程序，分別設(shè)置不同的加熱溫度340,380,410,430,450 ℃，測(cè)定同一醬油樣品的還原糖含量。

圖1 還原糖滴定程序Fig.1 Reducing sugar titration procedure

加熱溫度(℃)還原糖含量(g/dL)結(jié)果1結(jié)果2結(jié)果3平均值3802.6642.5692.6272.6204102.7722.7952.7232.7634302.8522.9262.8942.8914502.8812.8672.9142.887

由表1可知，加熱溫度較低時(shí)，結(jié)果較低，即滴定消耗的葡萄糖體積增加。加熱溫度為430 ℃時(shí)和450 ℃結(jié)果相近，430 ℃已能提供足夠穩(wěn)定的熱源，并保證其后滴定過程保持沸騰狀態(tài)。避免采用450 ℃或更高的溫度對(duì)儀器設(shè)備帶來的不良影響。

2.1.2 攪拌速度對(duì)結(jié)果的影響

反應(yīng)液攪拌用的轉(zhuǎn)子大小和攪拌的轉(zhuǎn)速不同，可引起測(cè)定誤差。轉(zhuǎn)子長度大的轉(zhuǎn)動(dòng)力度大，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)反應(yīng)液會(huì)產(chǎn)生較大的漩渦，造成電極浸泡不到反應(yīng)液而引起的檢測(cè)誤差，易觸碰到玻璃電極造成損壞。本研究使用較小的磁力轉(zhuǎn)子(長8 mm)，通過調(diào)整不同的轉(zhuǎn)速來測(cè)定比較，結(jié)果見表2。表明轉(zhuǎn)速小的，檢測(cè)結(jié)果低，即滴定終點(diǎn)滯后，滴定消耗的葡萄糖體積增加。500 r/min已是本儀器的最大設(shè)置值，50 mL小燒杯反應(yīng)液面沒有產(chǎn)生較大的漩渦，可滿足盡量減少測(cè)定誤差的要求。

表2 攪拌速度對(duì)結(jié)果的影響Table 2 Effect of stirring speed on results

2.1.3 滴定速度對(duì)結(jié)果的影響

國標(biāo)方法要求嚴(yán)格控制滴定的速度，1滴/2 s，人手控制的準(zhǔn)確性差，個(gè)體差異大。本研究應(yīng)用電腦程序精準(zhǔn)控制滴定速度，分別設(shè)為0.05 mL/s，0.05 mL/2 s，0.05 mL/3 s，結(jié)果見表3。

表3 滴定速度對(duì)結(jié)果的影響Table 3 Effect of titration speed on results

由表3可知，滴定速度越快，滴定消耗的葡萄糖體積越大，結(jié)果越小。滴定速度越慢，0.05 mL/3 s，滴定時(shí)間越長，反應(yīng)液的沸騰時(shí)間長會(huì)引起水分蒸發(fā)量大，堿液濃度增高。在一定范圍內(nèi)，溶液堿度越高，二價(jià)的銅還原越快，滴定消耗的體積越小，結(jié)果越大。為保持檢測(cè)的穩(wěn)定性，應(yīng)嚴(yán)格控制滴定速度和滴定時(shí)間。

2.1.4 滴定終點(diǎn)電位評(píng)估

還原糖測(cè)定的氧化還原反應(yīng)，應(yīng)用MET U模式等量滴定，受滴定速度1滴/2 s，反應(yīng)可逆等因素影響，終點(diǎn)電位突躍不大。若標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置較大(如>15 mV)，有可能造成儀器無法自動(dòng)判別出終點(diǎn)；若標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置較小(如<8 mV)，則可能提前識(shí)別出終點(diǎn)，即滴定消耗量偏小，滴定結(jié)果偏高。經(jīng)評(píng)估，對(duì)等當(dāng)量識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)EPC設(shè)為10 mV較適合。

經(jīng)以上測(cè)試，得出還原糖含量滴定在優(yōu)化參數(shù)，加熱面板溫度430 ℃、攪拌速度500 r/min，滴定速度0.05 mL/2 s，終點(diǎn)判斷電位評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為10 mV。應(yīng)用Tiamo軟件建立的設(shè)置見圖2。

圖2 還原糖滴定參數(shù)設(shè)置Fig.2 Setting of titration parameters for reducing sugar

2.2 回收率驗(yàn)證

用標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證，計(jì)算檢測(cè)方法的偏差，判斷方法的可行性，進(jìn)行回收率驗(yàn)證，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率結(jié)果Table 4 Recovery test of standard solution

再依據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中關(guān)于回收率范圍的規(guī)定[10]，見表5。

表5 回收率范圍Table 5 The range of recoveries

得出結(jié)論：配制濃度為0.1～10 g/dL的樣品檢測(cè)符合回收率范圍規(guī)定，此儀器檢測(cè)0.1～10 g/dL范圍的樣品結(jié)果符合使用。

2.3 醬油樣品還原糖檢測(cè)的精密度測(cè)試

表6 醬油還原糖含量檢測(cè)結(jié)果精密度Table 6 Precision of test results of reducing sugar content in soy sauce

由表6可知，應(yīng)用自動(dòng)電位滴定法測(cè)定3個(gè)不同的醬油樣品中還原糖的含量，RSD值分別為1.32%，1.13%，1.14%，均<2.00%，結(jié)果符合《含量測(cè)定分析方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于精密度的要求[11]，說明此方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，精密度高。

圖3 自動(dòng)電位滴定還原糖含量譜圖Fig.3 Spectrum of reducing sugar content by automatic potentiometric titration

由圖3可知等量滴定模式(MET U)下的滴定過程的曲線，能自動(dòng)根據(jù)電位變化識(shí)別出等當(dāng)點(diǎn)(EP1)，即滴定終點(diǎn)，避免因手工滴定需肉眼判斷顏色突變而引起的人為誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.4 醬油樣品還原糖加標(biāo)回收率的測(cè)試

表7 醬油還原糖加標(biāo)檢測(cè)回收率Table 7 Recovery rates of reducing sugar in soy sauce

由表7可知，向醬油b樣品中加入定量的葡萄糖標(biāo)樣(0.5～5 g/dL)，測(cè)定加標(biāo)后的回收率，分別為99.00%，98.40%，96.60%，96.92%，都在95%以上，回收率平均值為97.73%。

同時(shí)考慮常規(guī)發(fā)酵醬油產(chǎn)品還原糖含量在0.5%～10%之間，因此儀器符合發(fā)酵醬油檢測(cè)還原糖的要求。

3 結(jié)論

應(yīng)用電位滴定技術(shù)，電腦控制加熱和攪拌裝置，已摸索出較穩(wěn)定的程序參數(shù)。采用此方法檢測(cè)醬油中還原糖含量，結(jié)果精密度高，大大避免了人手滴定造成的誤差(尤其添加醬色后的醬油人手滴定終點(diǎn)判斷極為困難[12])。為醬油發(fā)酵過程的質(zhì)量監(jiān)控提供了準(zhǔn)確而有效的檢測(cè)監(jiān)控。