，，，

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學 海洋與漁業(yè)研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316022)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是存在于南極海域的海洋浮游生物，生物資源量巨大，是地球上最大的潛在動物性蛋白資源庫[1]。南極磷蝦蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，其生物價高于牛乳蛋白和其他動物性蛋白，必需氨基酸含量和評分也高于FAO/WHO推薦的理想蛋白模型，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸比值接近正常人的水平，極具開發(fā)應用潛力[2]。蛋白酶水解法是回收食品原料中蛋白質(zhì)的有效手段之一，通過添加外源酶酶解得到的水解蛋白營養(yǎng)豐富，腸道吸收更好，生物活性更優(yōu)異，包括抗氧化、降血壓、降血糖、抗菌等活性[3]。此外，蛋白水解后可用于制作風味制品，也可作為營養(yǎng)強化劑加入到其他食品中，提高其營養(yǎng)價值，是人們普遍關(guān)注的研究熱點[4]。實驗室前期制備了2種南極磷蝦蛋白產(chǎn)品——蝦糜和蛋白。因此，本文以它們?yōu)樵希ㄟ^動物蛋白水解商業(yè)復合酶制劑，制備南極磷蝦多肽，研究酶解參數(shù)，分析多肽分子量組成，并進一步評價其抗氧化活性，為南極磷蝦的精深加工提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

南極磷蝦：由作業(yè)船在南極海域捕撈，捕撈后迅速保存在-30 ℃冰柜中，冷凍方式：運至實驗室，貯藏于超低溫冰箱中；動物蛋白水解酶(2×105U/g)：河北格貝達生物科技有限公司；羥基自由基清除能力試劑盒和總抗氧化能力試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；細胞色素C(12400 Da)、抑肽酶(6511.44 Da)、維生素B12(1355.38 Da)、谷胱甘肽(612.63 Da)和胞苷(242.2 Da)：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Avanti JXN-30型冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；FreeZone 12型冷凍干燥機 美國Labconco公司；KjelFlex K-360型凱氏定氮儀 瑞士Buchi有限公司；UV-3100BPC型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；超高效液相色譜儀(UPLC) 美國Waters公司。

1.3 南極磷蝦蝦糜和蛋白的制備

南極磷蝦蝦糜和蛋白為實驗室自制，前者通過等電點沉淀法制備[5]，后者通過堿提酸沉法提取[6]，分別收集樣品，凍干備用。

1.4 南極磷蝦多肽的制備

以凍干南極磷蝦蝦糜粉和蛋白粉為原料，按液料比3∶1 (mL/g)加水復溶，調(diào)pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，加入動物蛋白水解酶，加酶量為500，1000，1500，2000，2500 U/g，在不同溫度下(40，45，50，55，60 ℃)保溫1，2，3，4，5 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶5 min。10000 g條件下離心15 min，取適量上清液，按1.5項下方法測定其水解度。其余上清液，凍干備用。

1.5 多肽水解度的測定

酶解上清液中可滴定氮含量參考鄒大維等人的方法，通過甲醛固定、堿液滴定測定[7]。總氮由凱氏定氮法測定。水解度(%)按公式(1)進行計算：

水解度=游離氨基氮/總氮量×100%。

(1)

1.6 多肽分子量范圍測定[8]

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class(紫外檢測器)對南極磷蝦多肽的相對分子質(zhì)量分布進行測定。色譜柱：Peptide CSH C18(130 ?，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。流動相A：含0.1%(V/V)三氟乙酸的超純水，流動相B：含0.1%(V/V)三氟乙酸的乙腈。梯度洗脫條件：初始條件為2%的B，在20 min時將B增加到50%，維持6 min后，將流動相B調(diào)節(jié)至2%，總時間為30 min。檢測波長214 nm和280 nm，柱溫40 ℃，流速0.1 μL/min，進樣量10 μL，進樣濃度0.02 g/mL。樣品分子量分布根據(jù)標準品保留時間確定。

1.7 羥基自由基清除能力測定

酶解凍干物用去離子水配成不同濃度(1.0～5.0 mg/mL)備用。羥基自由基清除測定參考試劑盒說明書進行。首先，將0.15 mL試劑1、0.4 mL試劑2和0.1 mL試劑3迅速混勻，防止局部顏色過濃。再加入0.25 mL樣品和0.1 mL試劑4，混勻，37 ℃下溫育60 min。反應結(jié)束后，10000 g離心10 min，測定536 nm下的吸光度值?？瞻捉M用去離子水替代樣品和試劑4，對照組用去離子水替代樣品。清除率按公式(2)計算：

清除率=(A樣品-A對照)/(A空白-A對照)×100%。

(2)

1.8 總抗氧化能力測定

酶解凍干物用去離子水配成不同濃度(1.0～5.0 mg/mL)備用?？偪寡趸芰y定參考試劑盒說明書進行。先繪制FeSO4濃度與反應吸光度變化(ΔA)的標準曲線。再將試劑1、試劑2和試劑3按7∶1∶1的比例混合，使用前預溫至37 ℃。取上述混合液900 μL，加入30 μL樣品(V樣品)和90 μL去離子水，充分混勻，此時總體積為1.02 mL(V反應)，反應10 min，測定593 nm處的吸光度A測定。對照組用去離子水代替樣品，測定得A對照。計算樣品的ΔA=A測定-A對照，代入標準曲線計算得到對應的Fe2+濃度x(μmol/mL)。總抗氧化能力按公式(3)計算：

總抗氧化能力(U/mL)=(x×V反應)/V樣品。

(3)

1.9 統(tǒng)計分析

所有實驗重復3次，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS進行t檢驗和多重Duncan比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

溫度是影響動物蛋白水解酶活性的主要因素之一。本研究在pH 8.0、加酶量2000 U/g、酶解時間3 h的條件下，測定40～60 ℃下動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.1 Effect of temperature on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

注：相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，下同。

由圖1可知，動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的酶解效果隨著溫度的升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，50 ℃時水解度達到最大值。當溫度低于50 ℃時，動物蛋白水解酶隨著溫度升高，反應速率加快，催化效率增強，水解度隨之顯著增大(P<0.05)；當溫度高于50 ℃時，動物蛋白水解酶的活性降低，反應速率降低，水解度隨之顯著減小(P<0.05)。因此，選擇50 ℃作為酶解最優(yōu)溫度，這與通過動物蛋白水解酶酶解單環(huán)刺螠體壁肌的研究結(jié)果一致[9]。

2.2 pH對南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

與溫度類似，pH也是影響動物蛋白水解酶活性的主要因素。本研究在溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、酶解時間3 h的條件下，測定pH 7.0～9.0下動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of pH on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖2可知，動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的酶解效果隨著pH的升高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當pH為8.0時，水解度達到最大值，當pH低于8.0時，動物蛋白水解酶活性隨pH增大而增強，所以水解度隨之顯著增大(P<0.05)；當pH>8.0時，動物蛋白水解酶的活性降低，水解度隨之顯著減小(P<0.05)，因此，8.0為最佳酶解pH。徐錦等人研究了6種商品蛋白酶對鰱魚蛋白的水解效果，同樣發(fā)現(xiàn)動物蛋白酶的最優(yōu)酶解pH為8.0，與本文的結(jié)果一致。

2.3 加酶量對南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

加酶量是影響動物蛋白水解效率的重要因素。本研究在溫度50 ℃、pH 8.0、酶解時間3 h的條件下，測定500～2500 U/g加酶量下動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of additive amount of enzyme on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖3可知，當南極磷蝦蝦糜和蛋白原料底物充足時，動物蛋白水解酶的酶解效果隨著加酶量的增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢(P<0.05)，但當加酶量超過2000 U/g時，由于酶解底物蛋白量有限，水解度無顯著性變化(P>0.05)。因此，確定2000 U/g為最優(yōu)加酶量。

2.4 酶解時間對南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

酶解時間是影響動物蛋白水解酶活性的因素之一。本研究在溫度50 ℃、pH 8.0、加酶量2000 U/g的條件下，測定酶解時間1～5 h下動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時間對南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖4可知，在前3 h內(nèi)，動物蛋白水解酶對南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度隨酶解時間的延長而顯著增加(P<0.05)，然而，當時間超過3 h時，由于南極磷蝦蝦糜和蛋白得到了充分水解，水解度無顯著性變化(P>0.05)。因此，確定3 h為最優(yōu)酶解時間。戴志遠等人從呈味角度分析了動物蛋白水解酶對梅魚酶解的效果，發(fā)現(xiàn)充足的酶解時間(4 h)有利于鮮味游離氨基酸的獲得，可提高產(chǎn)品的風味品質(zhì)[10]。

2.5 南極磷蝦多肽的分子量分布

圖5 南極磷蝦蝦糜多肽和蛋白多肽的UPLC色譜圖Fig.5 UPLC chromatograms of peptides derived from Antarctic krill surimi and protein

本文采用反相UPLC測定了南極磷蝦蝦糜多肽和蛋白多肽的分子量分布。隨著酶解反應的進行，南極磷蝦蛋白被水解成不同分子量肽段的混合物，其大小分布見圖5。

由圖5可知，動物蛋白水解酶水解南極磷蝦蝦糜和蛋白得到的多肽分子量集中在311～2963 Da之間。在波長214 nm下，2種原料來源的多肽都檢測到分子量為311，347，606，971，1483 Da的多肽；在波長280 nm下，來自南極磷蝦蛋白的樣品額外檢測到分子量為2963 Da的肽段。從分子量來看，本研究制備的南極磷蝦多肽符合生物活性肽分子量范圍大小(<6000 Da)，具有表現(xiàn)一定生物活性的潛力[11]。

2.6 南極磷蝦多肽抗氧化活性

Sila和Bougatef發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品是生物活性肽開采的巨大資源，尤其是抗氧化肽，如三肽Ser-Cys-His、四肽Ala-Cys-Phe-Leu、五肽Gly-Ser-Gly-Gly-Leu等[12]。如2.5所述，本文制備的南極磷蝦多肽具有一定活性潛力，因此，本文選取抗氧化性對其進行評價。

2.6.1 羥基自由基清除能力

圖6 南極磷蝦多肽的羥基自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging capacity of Antarctic krill peptides

由圖6可知，2種原料制備的南極磷蝦多肽對羥基自由基的清除率存在顯著差異(P<0.05)，并且隨著濃度的升高而增大，這可能與兩者組成的差異性有關(guān)。在多肽濃度為5.0 mg/mL時，羥基自由基的清除率最大，蝦糜多肽為16.7%±1.2%，蛋白多肽為25.0%±1.5%。陽性對照組VC在濃度0.5 mg/mL時，羥基自由基的清除率為43.6%±1.5%，與陽性對照相比，南極磷蝦多肽的羥基自由基清除能力較弱。

2.6.2 總抗氧化能力

圖7 南極磷蝦多肽的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of Antarctic krill peptides

由圖7可知，2種原料制備的南極磷蝦多肽的總抗氧化能力隨多肽濃度的升高而增大，但二者差異不顯著(P>0.05)，在多肽濃度為5.0 mg/mL時，總抗氧化能力最大，蝦糜多肽為(0.11±0.03) U/mL，蛋白多肽為(0.17±0.02) U/mL。陽性對照組VC在濃度為0.5 mg/mL時，總抗氧化能力高達(1.08±0.04) U/mL，與陽性對照相比，南極磷蝦多肽的總抗氧化能力較弱。

3 結(jié)論

本文將動物蛋白水解酶制劑應用于南極磷蝦蝦糜和蛋白的制備得到具有一定抗氧化能力的生物活性肽。單因素實驗表明最優(yōu)的酶解溫度為50 ℃，pH為8.0，加酶量為2000 U/g，酶解時間為3 h。在此條件下酶解，南極磷蝦多肽的分子量范圍為311～2963 Da，且具有一定的羥基自由基清除能力和鐵還原能力。