，

(1.陜西理工大學(xué) 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

油菜(BrassicacampestrisL.)，又名油白菜，是十字花科蕓薹屬植物。油菜籽在生產(chǎn)加工過程中會(huì)產(chǎn)生約55%的油菜籽粕，然而，油菜籽粕利用率較低，大部分用于肥料、飼料或者廢棄物垃圾等[1]。油菜籽粕富含蛋白質(zhì)、多酚、硫代葡萄糖苷、原花青素等活性成分[2-4]，尚未得到合理的開發(fā)。

黃酮作為一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[5]，其提取方法有溶劑法、超聲輔助法、微波輔助法、酶解輔助法、亞臨界水提法[6-10]等，其中超聲輔助法具有成本低、提取效率高、操作簡(jiǎn)單、技術(shù)可靠等優(yōu)點(diǎn)[11]。雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的黃酮分離技術(shù)，依據(jù)組分在上下相間的選擇性分配實(shí)現(xiàn)有效成分的分離，具有操作條件溫和、提取時(shí)間短、被分離物質(zhì)純度高等優(yōu)點(diǎn)[12]。關(guān)于油菜籽粕中黃酮或多酚的文獻(xiàn)報(bào)道較多[13]，但未見超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取油菜籽粕中黃酮的研究。因此，本文采取超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相法對(duì)油菜籽粕中的黃酮進(jìn)行工藝優(yōu)化，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其抗氧化活性，旨在為油菜加工副產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于南京奧多福尼生物科技有限公司；鄰苯三酚、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)：購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 主要儀器

Cary50紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安(中國(guó))有限公司；JXL-2S-6A數(shù)顯恒溫水浴鍋 浙江省金壇市金祥龍電子有限公司；EL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；SB-4200DTD型超聲波清洗器 北京新芝生物科技股份有限公司；800型離心機(jī) 上海手術(shù)機(jī)械廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 樣品制備及黃酮含量的測(cè)定

油菜籽粕：購(gòu)于陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)菜市場(chǎng)；市購(gòu)油菜籽粕置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，多功能粉碎機(jī)中打磨粉碎，過80 目篩，篩濾3遍。正己烷中浸泡脫脂脫色，烘干至恒重，密封備用。

準(zhǔn)確稱取已處理的油菜籽粕2.0000 g，按照一定的料液比加入不同濃度的乙醇水溶液和適量的硫酸銨，在一定溫度、功率的超聲波清洗器中提取一定時(shí)間，然后減壓抽濾，收集濾液至分液漏斗中，靜置、分層，收集上層提取液于錐形瓶中。準(zhǔn)確移取一定體積的黃酮提取液于50 mL容量瓶中，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定油菜籽粕提取液中的黃酮濃度，由下式計(jì)算超聲輔助雙水相提取油菜籽粕黃酮的提取量：

黃酮提取量(mg/g) = C×V×N/M。

式中：C為黃酮濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為稱取油菜籽粕粉末的質(zhì)量(g)。

1.4 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)文獻(xiàn)[14]稍作修改。準(zhǔn)確配制0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，依次吸取4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0，20.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，放置5 min；然后加入10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，搖勻，放置5 min；顏色不再變后加入5 mL 4%的NaOH，最后用30%的乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，10 min后以30%的乙醇溶液做參比，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁樣品液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=18.074x+0.1719，R2=0.9993。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 乙醇濃度的選擇

固定硫酸銨用量0.2 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30(g/mL)，超聲功率240 W，考察乙醇濃度為20%，30%，40%，50%，60%時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.5.2 硫酸銨用量的選擇

固定乙醇濃度40%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30(g/mL)，超聲功率240 W，考察硫酸銨用量為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/mL時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.5.3 提取溫度的選擇

固定硫酸銨用量0.2 g/mL，乙醇濃度40%，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30(g/mL)，超聲功率240 W，考察提取溫度30，40，50，60，70 ℃時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.5.4 提取時(shí)間的選擇

固定硫酸銨用量0.2 g/mL，乙醇濃度40%，提取溫度50 ℃，料液比1∶30(g/mL)，超聲功率240 W，考察提取時(shí)間10，20，30，40，50 min時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.5.5 料液比的選擇

固定硫酸銨用量0.2 g/mL，乙醇濃度40%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，超聲功率240 W，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.5.6 超聲功率的選擇

固定硫酸銨用量0.2 g/mL，乙醇濃度40%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30(g/mL)，考察超聲功率200，240，280，320，360 W時(shí)油菜籽粕黃酮的提取量。

1.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取硫酸銨用量、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲功率5個(gè)對(duì)油菜籽粕黃酮提取量影響較大的因素，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件L16(45)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化油菜籽粕黃酮的最佳工藝條件并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.7 抗氧化活性

參考文獻(xiàn)[15]的方法，以抗壞血酸作對(duì)照，考察油菜籽粕黃酮對(duì)·OH和O2-·的清除能力。

·OH清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損-A損傷)×100；

O2-·清除率(%)=[A0-(A樣品-A1)]/A0×100。

式中：A0表示自由基溶液的吸光度值；A樣品表示測(cè)定樣品的吸光度值；A1表示測(cè)定油菜籽粕黃酮溶液自身的吸光度值；A損傷表示只加自由基溶液的吸光度值；A未損表示不加入樣品和過氧化氫溶液的吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均為測(cè)定3次、取平均值，采用Origin 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用F檢驗(yàn)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

圖1 乙醇濃度對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由圖1可知，在硫酸銨質(zhì)量濃度一定的條件下，黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40% 時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最高值，而后黃酮提取量隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加而下降。分析原因可能是當(dāng)乙醇濃度較小時(shí)，溶劑的極性較高；隨著乙醇濃度的增加，溶劑的極性逐漸降低，因此黃酮提取量隨之逐漸增加，而當(dāng)乙醇濃度大于40%時(shí)，溶劑的極性過低，從而導(dǎo)致總黃酮提取量反而開始降低。結(jié)合雙水相體系的穩(wěn)定性，本研究體系固定乙醇濃度為40%進(jìn)行其他參數(shù)的選擇。

2.1.2 硫酸銨用量對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

由圖2可知，隨硫酸銨用量的增加，油菜籽粕黃酮的提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，0.3 g/mL時(shí)達(dá)到最大值?？赡茉蚴橇蛩徜@質(zhì)量濃度可以改變兩相中物質(zhì)的組成和相比，從而影響油菜籽粕黃酮在乙醇相中的分配；當(dāng)硫酸銨濃度過大時(shí)，在雙水相體系中有少量硫酸銨固體析出，導(dǎo)致黃酮提取量逐漸下降。故硫酸銨的濃度確定為0.3 g/mL。

圖2 硫酸銨濃度對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentration on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.1.3 提取溫度對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

圖3 提取溫度對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由圖3可知，隨提取溫度的增加，油菜籽粕黃酮提取量出現(xiàn)先增加，再穩(wěn)定在一定水平后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度在40～60 ℃時(shí)，黃酮提取量穩(wěn)定在(5.07±0.06)mg/g，隨著提取溫度的延長(zhǎng)，油菜籽粕黃酮提取量出現(xiàn)下降，可能是由于超聲輔助提取溫度的升高，促使部分黃酮發(fā)生分解、氧化等反應(yīng)，或上層乙醇相中黃酮的分解程度大于下層硫酸銨相中的分解程度導(dǎo)致雙水相體系發(fā)生變化。故選擇提取溫度為50 ℃為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，油菜籽粕黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，30 min時(shí)達(dá)到極值。這主要是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用促使某些黃酮類成分發(fā)生縮合、氧化或降解等反應(yīng)而被破壞，使含量降低。故選擇30 min為最佳的提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.1.5 料液比對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

圖5 料液比對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

由圖5可知，隨著料液比的變化，油菜籽粕黃酮提取量呈現(xiàn)先上升后下降緩慢的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20(g/mL)時(shí)，油菜籽粕黃酮提取量為(5.31±0.07)mg/g。原因是提取液的增多，促使提取溶液與油菜籽粕充分接觸，促使黃酮溶出，1∶20(g/mL)時(shí)達(dá)到極值；繼續(xù)增多提取溶劑，油菜籽粕中黃酮的溶出達(dá)到飽和或一些醇溶性雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性浸出促使黃酮提取量下降且變化緩慢。故選擇料液比為1∶20(g/mL)為宜。

2.1.6 超聲功率對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響。

由圖6可知，油菜籽粕黃酮提取量隨超聲功率的變化而變化，280 W時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)加大超聲功率，黃酮提取量逐漸降低?？赡苁怯捎诔暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)促使一些黃酮活性成分發(fā)生降解、聚合等反應(yīng)促使提取量下降，故選擇超聲功率為280 W。

圖6 超聲功率對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids from rapeseed meal

2.2 油菜籽粕黃酮雙水相提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合雙水相體系的穩(wěn)定性，固定乙醇濃度為40%。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1 The experimental design and results of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal test results

注：P<0.05，“*”表示影響顯著。

由表1可知，硫酸銨濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)和超聲功率(E)對(duì)油菜籽粕黃酮提取量均有一定的影響，其影響大小次序?yàn)椋篈>E>D>B>C，最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D3E3，即硫酸銨濃度0.3 g/mL，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超聲功率280 W。由表2方差分析結(jié)果可知，硫酸銨濃度和超聲功率對(duì)油菜籽粕黃酮提取量的影響最為顯著。

2.3 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)油菜籽粕黃酮提取工藝的最優(yōu)組合為A2B2C3D3E3，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，得到油菜籽粕黃酮的平均提取量為(5.53±0.03) mg/g。與正交試驗(yàn)表中最大黃酮提取量相比，表明該油菜籽粕黃酮提取工藝穩(wěn)定可行，從而確定最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度40%，硫酸銨濃度0.3 g/mL，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超聲功率280 W。

2.4 油菜籽粕黃酮的抗氧化活性研究

2.4.1 對(duì)羥基自由基(·OH)的清除

油菜籽粕黃酮和Vc對(duì)·OH的清除能力試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 油菜籽粕黃酮和Vc對(duì)·OH的清除能力Fig.7 Scavenging effect of flavonoids and Vc from rapeseed meal on ·OH

由圖7可知，隨著樣品濃度的增加，油菜籽粕黃酮和Vc對(duì)·OH的清除能力逐漸增強(qiáng)。在樣品濃度為0.0504 mg/mL時(shí)，油菜籽粕黃酮對(duì)·OH的清除能力明顯弱于Vc溶液。隨著樣品濃度升高，0.0504～0.1008 mg/mL時(shí)油菜籽粕黃酮對(duì)·OH的清除率呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，0.1008～0.1344 mg/mL時(shí)，清除率上升緩慢。當(dāng)總濃度為0.1344 mg/mL時(shí)，油菜籽粕黃酮對(duì)·OH的清除率為89.6%，而相同濃度下的Vc對(duì)·OH的清除率為99.2%，總體而言，油菜籽粕黃酮對(duì)·OH具有一定的清除活性。結(jié)果表明油菜籽粕黃酮的抗氧化活性遠(yuǎn)不及還原能力較強(qiáng)的抗壞血酸。

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除

油菜籽粕黃酮和Vc對(duì)O2-·的清除活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 油菜籽粕黃酮和Vc對(duì)O2-·的清除能力Fig.8 Scavenging effect of flavonoids and Vc from rapeseed meal on O2-·

由圖8可知，油菜籽粕黃酮在低濃度條件下，對(duì)O2-·的清除能力與Vc近似。隨著2種樣品濃度升高，油菜籽粕黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，0.084～0.168 mg/mL時(shí)，清除率上升緩慢；當(dāng)加入油菜籽粕黃酮濃度為0.294 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到穩(wěn)定值(86.9±0.25)%。當(dāng)總濃度為0.378 mg/mL時(shí)，油菜籽粕黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率為87.3%，而相同濃度下的Vc對(duì)超氧陰離子的清除率為91.6%。結(jié)果表明油菜籽粕黃酮對(duì)O2-·的清除率清除活性弱于抗壞血酸。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以油菜籽粕為原料，以黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取并優(yōu)化工藝。結(jié)果表明：油菜籽粕黃酮的最優(yōu)提取工藝組合為A2B2C3D3E3，即硫酸銨濃度0.3 g/mL，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超聲功率280 W，油菜籽粕黃酮的平均提取量為(5.53±0.03)mg/g。體外抗氧化活性研究表明，油菜籽粕黃酮提取液對(duì)·OH和O2-·均具有一定的清除活性，且隨著油菜籽粕黃酮質(zhì)量濃度的增加，清除率均逐漸增加。當(dāng)油菜籽粕黃酮質(zhì)量濃度為0.1344 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率為89.6%；當(dāng)油菜籽粕黃酮質(zhì)量濃度為0.378 mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子的清除率為87.3%，均弱于同濃度條件下Vc的清除能力。

本研究證明了油菜籽粕黃酮含量較高且具有一定的體外抗氧化活性，由于油菜籽粕利用率較低，大部分作為廢棄物處理，本研究為油菜副產(chǎn)品的綜合開發(fā)與利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。