,*,,,,
(1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院,成都 610065;2.四川徽記食品股份有限公司,成都 610065)
納豆是日本傳統(tǒng)的發(fā)酵食品,經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成,富含小分子氨基酸、寡聚糖和有機(jī)酸等多種易被人體吸收的營養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)也含有納豆激酶、苷元型異黃酮和維生素K2等多種生物活性物質(zhì),對(duì)預(yù)防和治療血栓和骨質(zhì)疏松等具有較好的作用[1-4]。但是枯草芽孢桿菌在發(fā)酵后,由于蛋白酶的作用會(huì)使蛋白質(zhì)在分解成氨基酸的同時(shí)產(chǎn)生具有不良風(fēng)味的氨味物質(zhì),因而降低了消費(fèi)者對(duì)納豆的接受度。
對(duì)此,已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了如何降低納豆中氨味物質(zhì)的含量。陳文珊等的研究發(fā)現(xiàn)在向原材料中加入3%的味精和10∶1的姜汁后,再經(jīng)發(fā)酵所得的納豆產(chǎn)品香氣、硬度適宜,并且拉絲性好,氨味含量明顯降低[5];董岳峰等的研究報(bào)道顯示當(dāng)薏米和黃豆的質(zhì)量比為2∶8時(shí),由于薏米的糖質(zhì)和大豆中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為了納豆的碳水化合物,故而產(chǎn)品的黏液較多、氣味芳香,口感得到了大幅提升[6];金虎等的研究表明當(dāng)納豆芽孢桿菌和乳酸菌的接種體積比為1∶1.6時(shí)不僅對(duì)納豆激酶的分泌有促進(jìn)作用,而且可以明顯改善納豆風(fēng)味和降低游離氨基的含量[7]。目前的研究均只是單一地從改變菌種、原料配比和添加調(diào)味料方面來改變或掩蓋納豆產(chǎn)品的氨味,而對(duì)2種或2種以上方式改善納豆風(fēng)味與營養(yǎng)特性的對(duì)比研究鮮有報(bào)道。
因此,本研究旨在通過感官評(píng)價(jià)結(jié)合對(duì)揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活性的測定分別選出傳統(tǒng)發(fā)酵方式、復(fù)合菌種發(fā)酵方式和復(fù)合原料發(fā)酵方式中的最佳工藝條件,最后對(duì)比復(fù)合菌種發(fā)酵產(chǎn)品和復(fù)合原料發(fā)酵產(chǎn)品與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品和市售納豆產(chǎn)品對(duì)比,獲得一種既能滿足中國人感官嗜好又能保留納豆更多營養(yǎng)成分的工藝。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑
小金黃690珍珠粒黃豆、圓江糯米:成都市沃爾瑪超市;市售3種納豆D,E,F(xiàn):京東商城;納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌:中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、氧化鎂、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸鈉、酪蛋白、L-酪氨酸:均為分析純;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、甘露醇、吐溫80、K2HPO4·7H2O、三水醋酸鈉、檸檬酸三銨、MgSO4·7H2O 、MnSO4·4H2O、瓊脂粉、NaCl:蜀都儀器有限公司。
1.1.2 儀器
LDZF-75L立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安儀器有限公司;DZKW-4電子恒溫水浴鍋、DL-1電熱爐、DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;FA-25勻漿機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;78-1磁力攪拌器 上海雙捷儀器有限公司;BMS-220分析天平 上海卓精電子科技有限公司;SW-CJ-1D落地式潔凈工作臺(tái) 上海力辰邦西儀器科技有限公司;QSY全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海新家儀器有限公司;UV-6000PC紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;GY-A228N超低溫冰箱 上海仙象儀器儀表有限公司;MP511 Lab pH Meter 上海三信儀表廠。
1.2.1 培養(yǎng)基的制備
1.2.1.1 植物乳桿菌種子培養(yǎng)基
蛋白胨3.5 g,牛肉膏1.75 g,酵母粉1.4 g,甘露醇7 g,吐溫80 0.35 mL,K2HPO4·7H2O 0.7 g,三水醋酸鈉1.75 g,檸檬酸三銨0.7 g,MgSO4·7H2O 0.07 g,MnSO4·4H2O 0.0175 g,瓊脂粉5.25 g,將上述成分加入到350 mL蒸餾水中,pH調(diào)至6.5。
1.2.1.2 納豆芽孢桿菌種子培養(yǎng)基
蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 5 g/L,pH值7.2。
1.2.2 種子液的制備
先將保藏于-80 ℃冰箱中的納豆芽孢桿菌和植物乳桿菌從冰箱中取出,放置于40 ℃水浴鍋中復(fù)蘇(50~100 s),再分別于無菌操作臺(tái)上轉(zhuǎn)接于LB和MRS斜面培養(yǎng)基上,然后分別放入28,37 ℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,得到活化的菌株,完成第1代活化。挑取活化后的納豆芽孢桿菌于納豆芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間14 h;挑取活化后的植物乳桿菌于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行靜置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h,完成活化。
1.2.3 傳統(tǒng)發(fā)酵制作工藝流程
1.2.4 操作說明
1.2.4.1 小黃豆浸泡時(shí)間
選擇顆粒飽滿、大小均勻的小黃豆10 g分別置于250 mL燒杯中,洗凈,然后放入30 mL室溫的清水,靜置,直到其體積為浸泡前的2.2~2.5倍。
1.2.4.2 蒸煮
將浸泡好的小黃豆放入高壓殺菌鍋中,在121 ℃,100 kPa條件下蒸煮20 min。蒸煮后豆粒易被手捏碎為宜。
1.2.4.3 冷卻
無菌環(huán)境下冷卻至室溫(不燙手為宜,或40 ℃以下即可)。
1.2.4.4 接種
去除不飽滿和漲裂的小黃豆,將納豆芽孢桿菌菌液(按干黃豆質(zhì)量計(jì))按照5.0%,8.0%,11.0%,14.0%分別加入小黃豆中攪拌均勻,分別標(biāo)記為A1,A2,A3,A4。
1.2.4.5 發(fā)酵
將接好種的原料用消毒過的紗布蓋好,放入恒溫、恒濕箱中,溫度為40 ℃,濕度約為80%,發(fā)酵時(shí)間為22 h。
1.2.4.6 低溫后熟
在4~5 ℃的低溫條件下后熟24 h,使產(chǎn)品風(fēng)味更佳,然后放入-20 ℃冰箱中冷凍保藏。
1.2.4.7 產(chǎn)品保藏
將制作好的納豆產(chǎn)品置于-20 ℃環(huán)境下保藏。
1.2.5 復(fù)合菌種發(fā)酵制作工藝
除在發(fā)酵時(shí)分別接種5.0%,8.0%,11.0%,14.0%的納豆芽孢桿菌和植物乳桿菌的混合菌液(按干黃豆質(zhì)量計(jì),混合比為1∶1)外,其他操作步驟均相同。樣品編號(hào)為B1,B2,B3,B4。
1.2.6 復(fù)合原料發(fā)酵制作工藝
除原材料按照糯米和小黃豆質(zhì)量比為1∶9,2∶8,3∶7或4∶6添加和納豆芽孢桿菌的接種量參考傳統(tǒng)發(fā)酵中最優(yōu)接種量加入外,其他操作步驟均相同。樣品編號(hào)為C1,C2,C3,C4。
1.2.7 納豆感官指標(biāo)的測定
納豆感官評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)見表1,采用百分制,測定指標(biāo)包含色澤、氣味、口感和粘滯性。
表1 納豆感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of natto
1.2.8 氨基酸態(tài)氮含量的測定
參考GB 5009.235—2016的酸度計(jì)法測定[8]。
1.2.9 揮發(fā)性鹽基氮的測定
參考GB 5009.228—2016的方法測定[9]。
1.2.10 納豆激酶活性的測定
參考GB/T 23527—2009的福林法測定[10]。
采用SPSS V19.0和Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出3次重復(fù)測量所得的平均值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表達(dá),并進(jìn)行ANOVA分析和Duncan顯著性檢驗(yàn),不同顯著性數(shù)據(jù)用不同字母標(biāo)記。
不同發(fā)酵方式對(duì)納豆感官品質(zhì)的影響見表2。
表2 不同發(fā)酵方式對(duì)納豆感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different fermentation methods on the sensory quality of natto
續(xù) 表
注:大寫字母D,E,F(xiàn)分別表示3種市售納豆。
制品好的納豆菌胎是半透明到透明狀,菌胎厚且完全覆蓋豆粒。攪拌后黏液多且呈半透明至透明狀,豆粒完整,無大量破損。放置后納豆表面具有光澤,且用筷子挑起,絲不斷,具有納豆特有的風(fēng)味[11]。
以色澤、氣味、口感和粘滯性4個(gè)指標(biāo)對(duì)3種不同發(fā)酵工藝進(jìn)行感官評(píng)價(jià),結(jié)果表明:傳統(tǒng)發(fā)酵方式中,當(dāng)納豆桿菌的菌液添加量為14.0%時(shí)其綜合評(píng)分最高,制得的納豆產(chǎn)品呈淺黃色,口感酥軟,較為濕潤且黏液多,拉絲長,效果較好,但是其氨味較重,消費(fèi)者對(duì)其的接受性不是很好;在發(fā)酵劑改為復(fù)合菌液發(fā)酵時(shí),當(dāng)添加量為5.0%時(shí)其感官綜合評(píng)分最高,制得的產(chǎn)品顏色呈金黃色,有一定光澤,略帶有氨味,口感濕潤酥軟且拉絲效果好,消費(fèi)者較能接受;改變原材料配比,當(dāng)糯米和小黃豆的添加量為2∶8時(shí),納豆的感官評(píng)分值最高,制得的納豆產(chǎn)品顏色呈金黃色,有一定光澤,具有納豆和糯米特有的香味,氨味不是很明顯,口感濕潤酥軟且拉絲效果好,消費(fèi)者大多能接受。對(duì)市售3種納豆產(chǎn)品的結(jié)果分析表明3種納豆呈金黃色,有一定光澤,氨味較重,口感濕潤酥軟且拉絲效果好,消費(fèi)者接受性較弱。
綜上所述,通過感官品評(píng)人員對(duì)產(chǎn)品的品評(píng)發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)發(fā)酵制得納豆的可接受性低于其他2種發(fā)酵工藝;市售納豆的感官評(píng)分值偏低,由此可推測多數(shù)人購買納豆的可能原因是納豆具有一定的營養(yǎng)保健功能,而對(duì)口感要求較低[12]。
傳統(tǒng)納豆制作需經(jīng)過浸泡、蒸煮、冷卻、接種、發(fā)酵和后熟工藝,接種的是單一菌種——納豆菌[13]。納豆?fàn)I養(yǎng)豐富,100 g納豆的蛋白質(zhì)量相當(dāng)于80 g肉或3個(gè)雞蛋。納豆不僅對(duì)原豆的營養(yǎng)成分有所保留,而且在發(fā)酵時(shí)大量的大豆蛋白轉(zhuǎn)化成易吸收的多肽和氨基酸,并且產(chǎn)生許多對(duì)人體有益的功能活性物質(zhì),例如納豆激酶、納豆黃酮和維生素K等。但是蛋白在分解為小分子氨基酸的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些氨味物質(zhì),影響口味。為了平衡營養(yǎng)和口味,文章對(duì)氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮和納豆激酶活性進(jìn)行了測定。
表3 傳統(tǒng)發(fā)酵方式對(duì)納豆品質(zhì)的影響Table 3 Effect of traditional fermentation method on the quality of natto
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05),下同。
由表3可知,隨著納豆芽孢桿菌菌液添加量的增加,氨基酸態(tài)氮的含量不斷增加,當(dāng)納豆芽孢桿菌菌液添加量為14.0%時(shí),氨基酸態(tài)氮含量最高,為0.35 g/100 g,各組間差異不顯著(p>0.05);分析原因是當(dāng)以一定含量蛋白為原料時(shí),納豆芽孢桿菌菌液添加量越大,對(duì)蛋白質(zhì)的分解越多,因而測得的氨基酸態(tài)氮值也越大。在發(fā)酵中期,氨會(huì)由氨基酸分解產(chǎn)生,質(zhì)量良好的納豆應(yīng)盡量減少氨的產(chǎn)生,實(shí)驗(yàn)中通過測定揮發(fā)性鹽基氮來檢測氨含量的變化[14],由表3可知,揮發(fā)性鹽基氮的含量也隨著納豆芽孢桿菌菌液添加量的不斷增加而降低,分析原因可能是接種量影響發(fā)酵程度,而發(fā)酵程度又直接與生物胺含量相關(guān)[15]。不同于其他指標(biāo),納豆激酶活性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,納豆芽孢桿菌菌液接種量為11.0%時(shí)納豆激酶活性最高,分析原因是當(dāng)接種量低時(shí)菌體生長速度慢,影響了正常代謝,而接種量過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵水分分布不均,發(fā)酵放熱,溫度升高,無法準(zhǔn)確控制發(fā)酵溫度,進(jìn)而會(huì)影響一些活性物質(zhì)的產(chǎn)生。
綜上所述,在傳統(tǒng)發(fā)酵方式中,當(dāng)納豆芽孢桿菌菌液的添加量為14.0%時(shí),制得的產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量最高,而揮發(fā)性鹽基氮值最??;因?yàn)锳3和A4組測得的納豆激酶值間差異不顯著(p>0.05),因此當(dāng)納豆芽孢桿菌菌液的添加量為14.0%時(shí),既可獲得較好口感又可達(dá)到高營養(yǎng)的要求。
納豆由于產(chǎn)生堿性物質(zhì)——小分子揮發(fā)性鹽基氮而有明顯氨味,而植物乳桿菌恰好在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生酸,二者產(chǎn)物綜合,可降低含氮物質(zhì)的產(chǎn)生,從而達(dá)到改善納豆風(fēng)味的目的。
因而,本研究考察了將植物乳桿菌和納豆芽孢桿菌互配發(fā)酵,互配菌種的添加量對(duì)納豆發(fā)酵品質(zhì)的影響見表4。
表4 復(fù)合菌種發(fā)酵方式對(duì)納豆品質(zhì)的影響Table 4 Effect of complex strains fermentation method on the quality of natto
續(xù) 表
由表4可知,氨基酸態(tài)氮隨著混合菌種添加量的增加而不斷增加,但組間差異不顯著(p>0.05),當(dāng)混合菌種添加量為14.0%時(shí)氨基酸態(tài)氮值最大。現(xiàn)已有文獻(xiàn)表明:納豆發(fā)酵過程中約55%的蛋白質(zhì)分解成水溶性氮化物,其中10%為游離氨基酸[16],而且其含量與納豆風(fēng)味直接相關(guān),其高低可作為納豆產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵控制點(diǎn);揮發(fā)性鹽基氮隨著混合菌種添加量的增加而不斷增加,分析原因可能是當(dāng)混合菌種添加量為5.0%時(shí),兩菌種可較好地發(fā)揮協(xié)同作用,其中植物乳桿菌可降解組氨酸、精氨酸等產(chǎn)生雜醇并與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)發(fā)生中和反應(yīng)產(chǎn)生酯類,對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味有改良作用;而后期菌粉增加由于二者競爭利用營養(yǎng)物質(zhì),影響了自身生長和代謝[17,18]。隨著混合菌種添加量的增加,納豆激酶活性不斷減小,組間差異顯著(p<0.05);當(dāng)混合菌種的添加量為5.0%時(shí),納豆激酶活性最高,為350.78 U/g,分析原因可能是過多地接種納豆菌和植物乳桿菌的混合菌液不僅會(huì)使菌種間協(xié)同作用不能發(fā)揮,而且也會(huì)由于二者競爭利用營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致納豆激酶產(chǎn)量降低[19,20]。
綜上所述,當(dāng)混合菌種的添加量為5.0%時(shí),制得的產(chǎn)品既可獲得較好口感又可達(dá)到高營養(yǎng)的要求。
糯米與小黃豆的營養(yǎng)成分含量不同,尤其是影響納豆風(fēng)味的氨基酸態(tài)氮含量不同,因而改變原料配比能夠從根本上改善納豆的風(fēng)味。改變發(fā)酵配比的本質(zhì)是改變碳氮比,一方面克服了單純添加香精香料和調(diào)味劑來掩蓋納豆氨味的局限性,另一方面不同原料營養(yǎng)價(jià)值不同也為納豆在醫(yī)療保健品的進(jìn)一步開發(fā)提供了重要途徑。
表5 復(fù)合原料發(fā)酵方式對(duì)納豆品質(zhì)的影響Table 5 Effect of mixed materials fermentation methodon the quality of natto
氨基酸態(tài)氮指以氨基酸形式存在的氮元素含量,其含量越高,營養(yǎng)越好[21]。由表5可知,隨著糯米占比的增加,氨基酸態(tài)氮的含量不斷減少,但是C2組分別與C1,C3和C4組間差異不顯著(p>0.05);因?yàn)榕疵字械暮康陀谛↑S豆,而氨基酸態(tài)氮的產(chǎn)生主要是納豆菌發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶,因此底物減少,自然產(chǎn)物也相應(yīng)降低[22]。揮發(fā)性鹽基氮在原料配比為2∶8時(shí),揮發(fā)性鹽基氮值最小,而后又增加,分析原因可能是糯米的糖質(zhì)含量高于小黃豆,在納豆的發(fā)酵過程中,糯米糖質(zhì)與小黃豆的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品納豆的碳水化合物,因而減少了游離氨的形成,從而改善了納豆風(fēng)味;而后期增加可能是糯米較黏、易結(jié)團(tuán),減少了與納豆菌的接觸面,影響了發(fā)酵,因而應(yīng)該控制好糯米的加入量[23]。納豆激酶在原料配比為2∶8時(shí)活性最高,且與其他3組相比差異顯著(p<0.05),其值為382.32 U/g。
綜上所述,在原料配比為2∶8時(shí),揮發(fā)性鹽基氮含量最小,而納豆激酶活性最高;又因?yàn)樵吓浔葹?∶8時(shí)實(shí)驗(yàn)所測氨基酸態(tài)氮與其他3組相比差異不顯著(p>0.05),因而為保證制得的產(chǎn)品既可獲得較好口感又可達(dá)到高營養(yǎng)的要求,可選擇原料配比為2∶8。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出的3種不同發(fā)酵方式最佳作用水平下制得的納豆與市售的3種納豆氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮和納豆激酶的測量結(jié)果見表6。
表6 3種發(fā)酵方式對(duì)納豆品質(zhì)影響的對(duì)比Table 6 Effect of three fermentation methods on the quality of natto
由表6可知,市售納豆的揮發(fā)性鹽基氮含量始終高于實(shí)驗(yàn)室自制的3種納豆;而市售納豆的納豆激酶活性始終低于實(shí)驗(yàn)室自制的3種納豆。僅對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制納豆所測定的指標(biāo)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn):復(fù)合原料發(fā)酵方式可以很好地降低揮發(fā)性鹽基氮含量,且與其他2種方式相比減少了2倍之多,差異顯著(p<0.05);與此同時(shí),復(fù)合原料發(fā)酵方式組測得的納豆激酶活性最高,其值為382.32 U/g,差異顯著(p<0.05),綜合考慮,實(shí)驗(yàn)室自制納豆中改變原料配比發(fā)酵方式制得的納豆品質(zhì)較好。觀察市售3種納豆的測量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):E納豆的揮發(fā)性鹽基氮含量最低,納豆激酶活性最高,而氨基酸態(tài)氮值與其他市售納豆相比差異不顯著(p>0.05);故3種市售納豆中E納豆最好。最后將實(shí)驗(yàn)室自制納豆中改變原料配比發(fā)酵組納豆與市售E納豆對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)二者氨基酸態(tài)氮值差異不顯著(p>0.05),實(shí)驗(yàn)室自制納豆的揮發(fā)性鹽基氮含量低于E納豆,而納豆激酶活性高于E納豆。
由表2感官分析結(jié)果可知, C2和E的感官評(píng)分值分別為82分和70分,再結(jié)合表6分析可知,與傳統(tǒng)發(fā)酵方式相比,復(fù)合菌種和復(fù)合原料2種發(fā)酵方式都可以較好地改善納豆風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì),這一研究結(jié)果與齊鳳元等和王瑞珍等的研究結(jié)果相一致,并且復(fù)合原料發(fā)酵方式制得的納豆品質(zhì)優(yōu)于市售納豆[24,25]。
本實(shí)驗(yàn)通過感官評(píng)價(jià)結(jié)合對(duì)揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活性的測定,以傳統(tǒng)菌種發(fā)酵方式為對(duì)照,研究了改變菌種發(fā)酵方式和改變原料配比發(fā)酵方式對(duì)納豆品質(zhì)的影響,并與市售的3種納豆做比較,通過分析得到以下研究結(jié)論:通過與傳統(tǒng)發(fā)酵方式對(duì)比發(fā)現(xiàn),復(fù)合菌種和復(fù)合原料2種發(fā)酵方式都可以較好地改善納豆風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì),但復(fù)合原料發(fā)酵方式組中當(dāng)糯米與小黃豆之比為2∶8時(shí)效果最好,且其品質(zhì)優(yōu)于市售的納豆。