，，，*

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510641；2.中新國際聯(lián)合研究院，廣州知識城，廣州 510555；3.海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

中國醬油歷史源遠流長，由于我國幅員遼闊、人們生活習慣不同，國內(nèi)醬油工業(yè)所用原料、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品品質(zhì)因地區(qū)不同有很大差異。按照制作方法的不同可分為釀造醬油和配制醬油。釀造醬油是指以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品。配制醬油是指以釀造醬油為主體，與酸水解植物蛋白調(diào)味液、食品添加劑等配制而成的液體調(diào)味品[1]。在醬油的色、香、味、體態(tài)等感官指標中，風味是最直觀、最受消費者關注的指標，隨儲藏時間的延長，醬油易出現(xiàn)不可逆的口感逐漸變苦的情況，導致醬油的風味物質(zhì)被掩蔽、營養(yǎng)價值降低，顯著影響了醬油儲藏期間的穩(wěn)定性[2]。因此，對于釀造醬油儲藏期間呈味分子變化的研究已成為調(diào)味品行業(yè)中亟待解決的問題。

醬油成分復雜，主要包括以大豆為主的蛋白質(zhì)原料水解后產(chǎn)生的肽、游離氨基酸，以小麥為主的淀粉質(zhì)原料水解后產(chǎn)生的糖類，還含有植物水解后的天然活性物質(zhì)如單寧、黃酮、酚酸等。由于地域和天氣條件不同，南北方的醬油雖都是以發(fā)酵為主，但制作工藝有所差別，風味也各有特色，南方醬油口味偏甜而北方醬油口味偏咸[3]。本研究選取兩種不同地域較有代表性的高鹽稀態(tài)法釀造醬油為研究對象，從醬油體系中不同化合物分子之間的氧化分解、分子聚集等角度入手，研究醬油在儲藏期間呈味分子的變化，探討影響醬油品質(zhì)穩(wěn)定性的原因，以期為醬油生產(chǎn)儲藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售高鹽稀態(tài)法釀造醬油(醬油Ⅰ、醬油Ⅱ)，購自廣州；細胞色素C(12,384 Da)、抑肽酶(6,511 Da)、桿菌肽(1450 Da)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)，購自Sigma公司；色譜級甲醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、碳酸鈉、沒食子酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸、濃鹽酸、溴水，均為分析純。

1.2 主要儀器設備

L-8900高速氨基酸分析儀 株式會社日立制作所；AKTA蛋白純化儀，SuperdexTMPeptide 10/300 GL色譜柱 通用電氣公司醫(yī)療集團；BSA124S萬分之一電子天平 德國賽多利斯集團；H2050R高速離心機 湘儀動力測試儀器有限公司；UV754N紫外分光光度計 上海儀電有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州溪華儀器有限公司；KDN-1型自動凱氏定氮儀 上海科曉科學儀器有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海培因實驗儀器有限公司；PHS-3C數(shù)顯臺式酸度計 上海浦春計量儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 常溫和加速儲藏試驗

醬油一般保質(zhì)期為1～2年，為縮短考察時間，可在加速儲藏條件下進行穩(wěn)定性試驗，考察樣品在儲藏期間呈味分子的變化。參考國家食品藥品監(jiān)管總局辦公廳印發(fā)的《保健食品穩(wěn)定性試驗指導原則》，將兩種不同品牌的市售醬油(醬油Ⅰ、醬油Ⅱ)分別在常溫和高溫下儲藏，參考相關文獻[4,5]，將加速儲藏條件設置為50 ℃、60% RH。分別測定不同儲藏條件和儲藏時間下醬油呈味分子的變化情況。

1.3.2 醬油單寧和游離酚含量的測定

取分別在常溫、50 ℃下儲藏0，5，10，15，20天的兩種醬油，參考NY/T 1600—2008、LS/T 6119—2017并作適當修改，測量其單寧和游離酚含量。

1.3.3 醬油氨基酸組成及含量的測定

取分別在50 ℃下儲藏0，20天的兩種醬油各50 μL，并稀釋至原體積的50～100倍，再以4%的三氯乙酸溶液稀釋10倍，10000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后備用。

以氨基酸分析儀檢測樣品的氨基酸組成情況。檢測條件：色譜柱為磺酸性陽離子交換色譜柱(60 mm×4.6 mm，3 μm)；分離柱柱溫57 ℃，反應柱柱溫135 ℃，進樣量20 μL，流速0.5 mL/min，檢測限為3 pmol。

1.3.4 醬油多肽分子量分布的測定

取分別在50 ℃下儲藏0，15，30天的兩種醬油各50 μL，并用0.02 mol/L PBS緩沖液稀釋至蛋白濃度為5 mg/mL，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后備用。蛋白質(zhì)含量的測定參考GB 5009.5—2010。

色譜檢測條件參考盧韻君等人的方法并做適當修改，檢測波長為214 nm，流速為0.5 mL/min，單次進樣量為500 μL，單次分析時間為80 min[6]。根據(jù)標準曲線，通過面積歸一化法計算各樣品多肽分子量分布。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

測定結果以P<0.05為顯著性評定指標，數(shù)據(jù)用x±SD表示，采用Graph Prism和Origin制圖。

2 結果與分析

2.1 醬油儲藏期間單寧和游離酚含量的變化

單寧是一類水溶性、分子量在500～3000 Da之間的酚類化合物，在植物界中廣泛分布，是一種重要的次級代謝產(chǎn)物，也是除木質(zhì)素以外含量最多的一類植物酚類物質(zhì)。單寧可與唾液中的蛋白質(zhì)發(fā)生化學反應，使口腔表層產(chǎn)生一種收斂性的觸感，人們通常形容為“澀”。單寧的含量與苦澀程度成正比，直接影響到醬油產(chǎn)品的風味。

沒食子酸標準曲線方程為y=0.117x+0.0222，R2=0.9994。根據(jù)此標準曲線可求出不同樣品中的單寧、游離酚含量，見圖1和圖2。

圖1 醬油I、Ⅱ在常溫(a)、50 ℃(b)儲藏后單寧含量變化Fig.1 The change of tannin content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由圖1可知，醬油Ⅰ和醬油Ⅱ的初始單寧含量有顯著性差異(P<0.05)，這與兩種品牌醬油的原料、生產(chǎn)工藝等密切相關。隨著儲藏時間的推移，兩種醬油中的單寧含量呈現(xiàn)上下波動的趨勢。但醬油Ⅰ的單寧含量波動較為劇烈，第5天的單寧含量與其余各時間均具有顯著性差異。而不同儲藏時間下醬油Ⅱ的單寧含量無顯著性變化。醬油中的小分子物質(zhì)黃烷-3-醇可發(fā)生聚合反應生成單寧，同時單寧在酸性條件下可發(fā)生水解作用[7]。水解作用與聚合反應的同時存在，表現(xiàn)為醬油中單寧含量在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)上下波動的現(xiàn)象。

根據(jù)存在形態(tài)的不同，多酚分為游離態(tài)多酚和結合態(tài)多酚[8]。游離態(tài)多酚是以單體形式被物理吸附或截留于食品基質(zhì)中的多酚，易溶于水或有機溶劑。結合態(tài)多酚是經(jīng)由共價鍵與食品基質(zhì)(如細胞壁物質(zhì))相結合的多酚，具有難萃取的特點。結合態(tài)多酚在酸、堿、酶等的作用下可發(fā)生水解反應，而導致多酚的流失。其中，酸水解反應主要通過破壞糖苷鍵來釋放結合態(tài)多酚，但不能釋放通過酯鍵結合的多酚，但是酸水解往往需要較高的溫度。糧谷類食品中的結合態(tài)多酚主要包括阿魏酸、香豆酸、羥基肉桂酸、可水解單寧等與多糖類物質(zhì)共價結合的酚酸類物質(zhì)[9]。目前關于酚類物質(zhì)對食品品質(zhì)影響的研究不盡一致，醬油體系復雜，多酚的含量在一定程度上決定了其抗氧化功能的強弱，但同時多酚又是苦澀味的來源之一。

圖2 醬油I、Ⅱ在常溫(a)、50 ℃(b)儲藏后游離酚含量變化Fig.2 The change of free phenol content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由圖2可知，醬油Ⅰ與醬油Ⅱ的初始游離酚含量有顯著性差異(P<0.05)，隨著儲藏時間的推移，兩種醬油中的游離酚含量在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則波動，但差異并不明顯。這種變化趨勢的產(chǎn)生與儲藏條件并無太大關系。據(jù)研究，醬油體系為酸性環(huán)境，在加熱條件下游離酚含量會顯著增加，這是由于酚酯熱分解所致[10]。未滅菌的醬油在80 ℃條件下加熱10 h后，其游離酚成分的含量會達到最高。同時，游離酚還是酶促褐變的底物，在多酚氧化酶的作用下可被氧化生成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)聚合生成黑色素，導致醬油在儲藏期間苦味加重、色澤變深。酸水解與酶促褐變同時存在，造成了醬油中游離酚含量的上下波動。

2.2 醬油儲藏期間氨基酸組成及含量的變化

氨基酸組成及含量在一定程度上影響著醬油的品質(zhì)。通常來說，醬油品質(zhì)鑒定各項指標中風味是最重要的，在醬油呈味體系中，以鮮味為主，其次是甜味和苦味。通過對50 ℃下儲藏0，20天的醬油Ⅰ和醬油Ⅱ的氨基酸組成進行測定，得出17種常見氨基酸的含量，見表1。結果表明，兩種品牌醬油的氨基酸組成基本一致，但含量各有不同。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，是醬油中的主要鮮味物質(zhì)。醬油中的谷氨酸主要來源于原料的蛋白質(zhì)，除了賦予醬油鮮美的味道外，還作為蛋白質(zhì)的一種成分被人體所吸收利用。醬油Ⅱ比醬油Ⅰ有更高的谷氨酸含量，且儲藏20天后，醬油Ⅰ和醬油Ⅱ中谷氨酸的含量都有所下降，這使得醬油鮮味有所消退。在醬油新產(chǎn)品的開發(fā)中，鮮味醬油、固體醬油、忌鹽醬油等都額外添加了一定量的谷氨酸，這樣既增強了產(chǎn)品的鮮味，又增加了營養(yǎng)物質(zhì)。谷氨酸作為特征氨基酸，可作為初步判斷產(chǎn)品是否添加鮮味劑谷氨酸鈉的依據(jù)，如果醬油中谷氨酸占總氨基酸的比例超過30%，可初步認定產(chǎn)品添加了谷氨酸鈉[11]。醬油Ⅰ的谷氨酸百分含量為65.32%，醬油Ⅱ的谷氨酸百分含量為80.05%，說明兩種醬油在制作過程中都人工添加了谷氨酸鈉以提高鮮味。除谷氨酸與未檢出的丙氨酸及半胱氨酸外，相同儲藏時間下醬油Ⅰ中其他各種氨基酸的含量均比醬油Ⅱ高。除谷氨酸外，天冬氨酸也是鮮味的主要來源。谷氨酸-天冬氨酸、谷氨酸-絲氨酸和在釀造過程中生成的一些低級肽也具有鮮味[12]。醬油Ⅰ中天冬氨酸、絲氨酸含量較高，醬油Ⅱ中谷氨酸含量較高，總體作用使得兩種醬油鮮味相當。

表1 醬油I、Ⅱ儲藏前后氨基酸組成及含量變化Table 1 The amino acid composition and content of soy sauceⅠ and Ⅱ before and after storage g/dL

注：“—”表示未檢出，同行不同肩標小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

醬油在釀造過程中產(chǎn)生的甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和脯氨酸對醬油甜味有重要作用[13]，總體來說，醬油Ⅰ呈甜味的氨基酸含量比醬油Ⅱ高，且50 ℃儲藏20天對甜味氨基酸含量幾乎無影響。

醬油中纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸是使醬油呈苦味的重要來源。醬油中適量苦味物質(zhì)的存在使得醬油的口感醇厚綿長，但好的醬油不應該有明顯苦味。50 ℃儲藏20天后醬油Ⅰ中纈氨酸、精氨酸的含量上升，蛋氨酸含量下降，異亮氨酸和苯丙氨酸基本不變；醬油Ⅱ中纈氨酸含量上升，蛋氨酸含量下降，異亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸基本不變。

醬油在儲藏期間，鮮味氨基酸含量的下降和苦味氨基酸含量的上升，是導致其風味發(fā)生不可逆變化的原因之一。

2.3 醬油儲藏期間多肽分子量分布的變化

美拉德反應是食品加工過程中廣泛存在的一種非酶褐變反應，主要是指羰基化合物(還原糖)與氨基化合物(氨基酸、肽和蛋白質(zhì))經(jīng)過分子聚合、Amiadori重排、Strecker裂解等一系列反應最終形成類黑精的復雜反應，該反應可生成大量的揮發(fā)性化合物和大分子量的聚合物。由于肽的結構和組成較為復雜，且在高溫條件下易發(fā)生裂解或聚合，尤其是在美拉德反應中，多肽除自身會發(fā)生熱降解外，還與還原糖類發(fā)生羰氨縮合反應，甚至會與中間產(chǎn)物分子發(fā)生反應，進而改變其分子結構。

據(jù)研究，分子量>10000 Da，5000～1000 Da的肽熱降解反應劇烈，美拉德反應體系中此段組分增多可能是由于小分子肽與木糖或其衍生物的縮合所導致的，反應體系中分子量<1000 Da的組分急劇減少，證明其具有良好的美拉德反應活性[14]。同時，劉平等發(fā)現(xiàn)在美拉德反應中，還原糖對肽的降解和交聯(lián)起促進作用，隨著反應時間的延長，>5000 Da的肽段含量增加，糖肽交聯(lián)作用明顯，而1000～5000 Da的肽段在反應1 h時增加3.86%，隨后緩慢降低[15]。根據(jù)相關報道[16,17]，分子量>6000 Da的肽沒有苦味。鄧勇等研究了大豆多肽分子質(zhì)量與苦味之間的關系，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在500～1000 Da之間的大豆多肽苦味最強[18]。葛文靜等利用SEC-HPLC，RP-HPLC對大豆酶解物進行分離純化，經(jīng)感官評價和儀器輔助評價，發(fā)現(xiàn)疏水性苦味肽是苦味的重要來源，大豆苦味肽分子量集中在200～5000 Da，其中以200～2000 Da的組分的苦味最重[19]。

由圖3(a)可知，利用凝膠色譜法對一系列已知分子量的標準品進行檢測，通過保留時間與標準品分子量常用對數(shù)值(log10)做標準曲線，以保留時間為縱坐標，標準品分子量為橫坐標，通過最小二乘法算出線性相關方程，可以獲得保留時間與分子量的關系，作為樣品分子量定性標準。由圖3(b)可知，標準曲線方程為y=94.762-16.964lg(x)，R2=0.9603。同時對分別在50 ℃下儲藏0，15，30天的醬油Ⅰ、醬油Ⅱ進行檢測。由圖3(c)和(d)可知，兩種醬油儲藏后在30～40 min處峰值變化最明顯，表現(xiàn)為該分子量肽段的占比增加，尤其是儲藏30天的醬油Ⅰ在20 min處出現(xiàn)明顯的大分子聚集。

圖3 標準品分子量色譜圖(a)、標準曲線(b)醬油Ⅰ(c)與醬油Ⅱ(d)儲藏后肽分子量分布的變化趨勢Fig.3 Standard molecular weight chromatogram (a)，standard curve (b), molecular weight distribution of peptides in soy sauce I (c) and soy sauce II (d) after storage

對圖3(c)和(d)進行積分，由面積歸一化法算出各分子量肽段所占比例，見圖4。

圖4 醬油Ⅰ(a)與醬油Ⅱ(b)儲藏期間各分子段肽占比Fig.4 Percentage of peptide molecular weight in soy sauce Ⅰ (a) and soy sauce II (b) during storage period

由圖4(a)可知，醬油Ⅰ在儲藏15天后，各分子段占比發(fā)生明顯變化，具體表現(xiàn)為：分子量<200 Da的小分子肽占比減少，2000～5000 Da分子段占比顯著增加。繼續(xù)儲藏至30天時，200～2000 Da和2000～5000 Da肽段占比略有下降，而<200 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升。由圖4(b)可知，隨著儲藏時間推移，醬油Ⅱ中分子量<200 Da和200～2000 Da的肽段占比略有減少，2000～5000 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升，但總體變化趨勢相對緩慢。該實驗結果與劉平等人的研究結論一致。因此，醬油在儲藏期間，不同分子量肽的變化可能導致其風味發(fā)生不可逆變化。

2.4 環(huán)境條件的改變加速呈味分子的變化

外界環(huán)境的改變也可能加速各種呈味分子的變化，最終影響醬油品質(zhì)的穩(wěn)定性。例如，溫度升高可以使美拉德反應加劇，氧氣的引入可促使酚類底物在多酚氧化酶的作用下發(fā)生酶促褐變，表現(xiàn)為“黑色素”的生成及醬油變苦、色澤變深。光的光化作用可能促進淀粉糖化、酒精發(fā)酵、蛋白質(zhì)降解、風味物質(zhì)形成和美拉德褐變等生化反應的進行，或影響微生物的繁殖代謝。也有研究指出光照本身對醬油品質(zhì)沒有直接的影響，但光照可以引起發(fā)酵基質(zhì)的溫度升高，從而使醬醪和醬油中各種生理生化反應加快，最終導致醬油品質(zhì)的差異[20]。

3 結論

由于原料和工藝的不同，成品醬油中單寧含量、游離酚含量、氨基酸組成及含量、多肽分子量分布存在差異，這些呈味分子在醬油儲藏期間會持續(xù)變化波動，可能導致醬油風味、色澤等發(fā)生不可逆變化，從而影響醬油儲藏期間的品質(zhì)穩(wěn)定性。