貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025

桂枝茯苓丸(Gui Zhi Fu Ling Pills，GZFLP)具活血化瘀、消癥散結(jié)之功，常用于治療瘀阻胞宮證。藥理研究表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，其作用機(jī)理與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用密切相關(guān)[1]。機(jī)體內(nèi)存在多種免疫監(jiān)視機(jī)制，發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用。而免疫活性細(xì)胞的致敏、激活和擴(kuò)增又依賴于抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)呈遞相應(yīng)的抗原多肽和共刺激信號(hào)。樹突狀細(xì)胞(dendrititc cell，DC)是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的APC，它能激活T細(xì)胞，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中起著重要作用[2]。DC在人外周血中含量較少，因此，尋找體外合適的DC前體細(xì)胞并誘導(dǎo)分化其成熟以獲得足夠多的DC是DC抗腫瘤治療的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)以人臍血作為DC前體細(xì)胞來源，采用桂枝茯苓丸體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，旨在進(jìn)一步研究桂枝茯苓丸抗腫瘤的機(jī)制，為中醫(yī)藥防治腫瘤提供一定依據(jù)。

1 儀器材料

1.1 臍血 在無(wú)菌下，采集健康足月妊娠產(chǎn)婦臍血100 mL/份，肝素抗凝。

1.2 藥物 桂枝茯苓丸(桂枝10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、桃仁10 g)購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥藥房，加適量水，浸泡2 h，先武火后文火煎煮2次，經(jīng)過濾除渣后，水浴濃縮成1 g/mL中藥水煎液，調(diào)pH值至7.0，經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，放4 ℃冰箱保存[3]。

1.3 試劑 RPMI1640培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司)；重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF，美國(guó)Pepro Tech公司))；IL-4試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人CD80、CD40、CD83和CD86(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；抗β-Actin單克隆抗體(北京康為生物技術(shù)有限公司)。

1.4 儀器 CJ-1D超凈工作臺(tái)(天津泰斯特公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Napco公司)；電控恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)；LD4-2A型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)； 電子天平(德國(guó)OHAUS公司)；倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；病理圖像分析系統(tǒng)(Motic Med CMIAS)；Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 臍血單核細(xì)胞的獲取 在無(wú)菌條件下，取新鮮臍血(肝素抗凝)9 mL，加入1倍體積的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，吹打混勻后2∶1疊加于淋巴細(xì)胞分離液層(淋巴細(xì)胞分離液與稀釋濃縮臍血比為1∶2)，經(jīng)密度梯度離心(20 ℃，2000 r/min，20 min)，離心后分為血清層、單個(gè)核細(xì)胞層(白膜層)、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層，小心吸取白細(xì)胞層，即為臍血單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗3次，每次1500 r/min，10 min，去除上清，用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，加入至75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3 h，收集貼壁的單核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。

2.2 體外培養(yǎng)及倒置相差顯微鏡觀察(采用6孔板，每孔2 mL) 將獲取的單核細(xì)胞分為4組即空白對(duì)照組、細(xì)胞因子組(GM-CSF+IL-4)、桂枝茯苓丸組(GZFLP)、桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組(GZFLP+GM-CSF+IL-4)進(jìn)行體外培養(yǎng)。各組取1 mL細(xì)胞懸液和1 mL10%胎牛血清，其中細(xì)胞因子組加入100 ng/mL GM-CSF20 μL及50 ng/mL的IL-4 20 μL，桂枝茯苓丸組加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中藥液，桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組分別加入1 mL100 μg/mL桂枝茯苓丸中藥液及100 ng/mLGM-CSF20μL+50 ng/mL的IL-420 μL。各組均置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，每日在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，重點(diǎn)觀察未成熟樹突狀細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色法 取無(wú)菌24孔培養(yǎng)板,每孔加入多聚賴氨酸溶液包被、烘干、每孔用PBS清洗3次、吹干，收集各組樹突狀細(xì)胞、經(jīng)PBS清洗用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞貼壁后去除完全培養(yǎng)基，再用PBS清洗3次，之后每孔加入4%多聚甲醛固定液固定20 min，去除多聚甲醛殘余液，使用瑞氏-吉姆薩染色液試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色、鏡下觀察。

2.4 Western Blot法檢測(cè) 依據(jù)細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒說明提取膜蛋白，依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)SDS-PAGE凝膠制備試劑盒灌膠和電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，按WB(HRP)試劑盒加入目的蛋白CD80、CD40、CD83、CD86染色，將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)底物工作液滴在印跡膜上，在暗室中將X光片置于膜上曝光，定影至膠片透明，風(fēng)干備用。

2.5 T細(xì)胞獲取和鑒定 取同種異體臍血，按上述方法獲得單核細(xì)胞，取非貼壁細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞，將3×107/mL的淋巴細(xì)胞注入尼龍毛柱，放入37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱靜置1 h。用預(yù)溫的37 ℃含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液洗柱，洗下的即為T細(xì)胞。取T細(xì)胞進(jìn)行涂片，丙酮固定10 min，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞呈CD3+亞型、CD20-型。將剩余T細(xì)胞放入上述培養(yǎng)液中，并加入細(xì)胞因子人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)500 μL，于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)待用。

2.6 MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖 將實(shí)驗(yàn)各組DC用絲裂霉素C(25 μg/mL)處理后作為刺激細(xì)胞，取獲得的T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。按1∶10、1∶50、1∶100的比例分別加刺激細(xì)胞及反應(yīng)細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中。每組3個(gè)復(fù)孔，其中T細(xì)胞為2×105/孔于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)4 d，每孔加入MTT20 μL繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心，棄上清，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 Min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D570值，結(jié)果用3個(gè)復(fù)孔平均值計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 單核細(xì)胞形態(tài) 單核細(xì)胞呈圓形、貼壁生長(zhǎng)、表面光滑、細(xì)胞核呈圓形、位于細(xì)胞中央。

3.2 倒置顯微鏡觀察各組DC結(jié)果 培養(yǎng)第1天，可見細(xì)胞小、均勻散在分布；第2天時(shí)，細(xì)胞大部分貼壁，有少量懸?。坏?天時(shí)細(xì)胞懸浮成簇，第7天時(shí)，各組懸浮細(xì)胞增多，體積增大；第12天時(shí)，細(xì)胞表面出現(xiàn)突起。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組DC數(shù)量最多，細(xì)胞因子組DC數(shù)量比桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組少、但比桂枝茯苓丸組多，空白對(duì)照組DC數(shù)量最少。如圖1所示。

3.3 瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果 培養(yǎng)5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞大小不一，胞質(zhì)呈藍(lán)紫色、細(xì)胞核多為圓形、未成熟DC細(xì)胞內(nèi)有大量囊泡，細(xì)胞表面突起短而少；而成熟DC細(xì)胞內(nèi)囊泡少，表面突起多而長(zhǎng)。桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組DC數(shù)量最多，桂枝茯苓丸組DC數(shù)量比桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組少、與細(xì)胞因子組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組DC數(shù)量最少。如圖2所示。

3.4 Western Blot法檢測(cè) 未成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表達(dá)見表1，成熟DC的CD80、CD40、CD83、CD86蛋白表達(dá)。見表2。

分組空白對(duì)照組因子組桂枝茯苓丸組桂枝茯苓丸+因子組 CD80/β-Actin0.069±0.0150.135±0.0180.115±0.0160.187±0.013?CD40/β-Actin0.056±0.0180.129±0.090.116±0.080.156±0.04?CD83/β-Actin0.0046±0.00310.0214±0.00210.0192±0.00150.0207±0.0014?CD86/β-Actin0.056±0.0040.140±0.0070.153±0.0080.188±0.005?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

分組空白對(duì)照組因子組桂枝茯苓丸組 桂枝茯苓丸+因子組CD80/β-Actin0.071±0.009 0.1921±0.00860.1878±0.01170.2141±0.0084?CD40/β-Actin0.061±0.034 0.927±0.040.884±0.0441.033±0.043?CD83/β-Actin0.021±0.013 0.494±0.035 0.456±0.0420.725±0.034?CD86/β-Actin0.062±0.034 0.917±0.049 0.912±0.0421.032±0.043?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

3.5 對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 見表3。

分組空白對(duì)照組因子組桂枝茯苓丸組桂枝茯苓丸+因子組1∶100.123±0.0120.654±0.0620.717±0.071 0.890±0.072?1∶500.095±0.0210.475±0.0370.493±0.042 0.569±0.039?1∶1000.074±0.0230.376±0.0250.327±0.039 0.353±0.041?

注：桂枝茯苓丸+因子組與其它組比較，*P<0.05。

4 討論

現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,機(jī)體的免疫力與疾病的發(fā)生密切相關(guān)?！秲?nèi)經(jīng)》“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”。祖國(guó)醫(yī)學(xué)的正氣即人體的免疫力，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是天然免疫與獲得性免疫的免疫活性物質(zhì)[4]。T細(xì)胞參與機(jī)體的細(xì)胞免疫，它具有識(shí)別異己、保護(hù)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。隨著腫瘤病人的增多，研究腫瘤疫苗已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。T細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)的介導(dǎo)者，它的功能活動(dòng)受到DC的監(jiān)控。在抗腫瘤中，DC是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，抗原的識(shí)別、攝取、加工、提呈及T細(xì)胞的致敏、激活和擴(kuò)增均依賴于抗原呈遞細(xì)胞的參與和調(diào)節(jié)，因此，DC可以啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)。研究證實(shí)，DC激發(fā)T細(xì)胞增殖及抗原提呈能力是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的100～1000倍，在抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞為主的腫瘤過繼免疫治療中起著十分重要的作用。在合適的細(xì)胞因子組合下，能夠在體外利用臍血成功誘導(dǎo)出成熟DC[5]。

目前，已發(fā)現(xiàn)多種可誘導(dǎo)DC成熟的刺激因子，如TNF-α、LPS、CD40L等[6]，但有一定的細(xì)胞毒性或功能尚未明確而限制了它們的應(yīng)用。中醫(yī)藥在防治腫瘤方面有較大的優(yōu)勢(shì)。尤其是中藥復(fù)方可針對(duì)腫瘤發(fā)病多因素的特點(diǎn)，因此，尋找中藥復(fù)方替代細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC成熟迫在眉睫。

桂枝茯苓丸出自張仲景《金匱要略》，該方由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥5味中藥組成，具有活血化瘀、消癥散結(jié)之功效，常用于治療婦科瘀阻胞宮證。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀是導(dǎo)致腫瘤的主要病因之一，大量臨床實(shí)踐證明，桂枝茯苓丸廣泛用于各種血瘀癥的治療[7]，在治療婦科腫瘤方面取得了可靠的療效。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，桂枝茯苓丸具有一定的抑瘤作用，該方的抑瘤作用機(jī)理與其對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，桂枝茯苓丸能促進(jìn)免疫功能低下荷瘤機(jī)體分泌細(xì)胞因子，有效殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。另有研究表明，桂枝茯苓丸的抗腫瘤作用機(jī)制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，通過影響腫瘤細(xì)胞Survivin、p21waf/cip等基因發(fā)揮抑瘤作用[9]。本研究將桂枝茯苓丸制備成1 g/mL中藥水煎液，調(diào)pH值至7.0，經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，能夠在除菌的同時(shí)充分保留其藥理活性。然而，目前對(duì)桂枝茯苓丸抑瘤機(jī)理的研究還待進(jìn)一步深入，其是否能通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成熟為DC，激活T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤作用，還未曾報(bào)道。

研究經(jīng)臍血單核細(xì)胞為前體細(xì)胞，以具有免疫、抗腫瘤作用的桂枝茯苓丸為誘導(dǎo)劑，探討桂枝茯苓丸體外對(duì)人臍血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞的分化、成熟及免疫活性的影響，并探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，各組單核細(xì)胞體外培養(yǎng)均可誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面有較多的樹突狀突起，有很強(qiáng)的促T細(xì)胞增殖能力。各組細(xì)胞表面標(biāo)志物蛋白(CD80、CD40、CD83、CD86)隨樹突狀細(xì)胞成熟表達(dá)增強(qiáng)，尤以桂枝茯苓丸+細(xì)胞因子組誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞多、表達(dá)強(qiáng)(P<0.05)、形態(tài)學(xué)特征更為明顯；誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)(P<0.05)。研究結(jié)果提示，桂枝茯苓丸可促進(jìn)人臍血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞分化、成熟、增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的免疫活性，并與細(xì)胞因子協(xié)同作用效果更佳。然而，桂枝茯苓丸誘導(dǎo)臍血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)還需進(jìn)一步研究，不同濃度的桂枝茯苓丸誘導(dǎo)人臍血單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞的效果的研究還需進(jìn)一步深入。此外，采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)樹突狀細(xì)胞表面蛋白的檢測(cè)、細(xì)胞周期的觀察是本課題下一步研究的重點(diǎn)。