王紹靖 陳曉瑞 菅喜岐

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第9 位，死亡率第6 位［1］。食管癌可分為鱗癌和腺癌兩種病理類型，中國食管鱗狀細(xì)胞癌占食管癌的90%［2］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后預(yù)后的主要因素之一。雖有多項探索食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究，但僅停留于基因表達(dá)水平的變化，如PIM-1、p53、p21和PCNA基因［3-4］，尚未發(fā)現(xiàn)基因突變相關(guān)的分子標(biāo)記。目前若干國際癌癥基因組研究項目如癌癥基因組圖譜（TCGA）提供了大量癌癥全外顯子組基因變異數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床資料［5］，為基因突變水平的研究提供了基礎(chǔ)資料。本研究利用這些基因數(shù)據(jù)及臨床資料，選擇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的91 例食管鱗狀細(xì)胞癌患者全外顯子體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探索與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集

從Broad GDAC Firehose網(wǎng)站（http：//gdac.broadinstitute.org/）下載TCGA數(shù)據(jù)庫中全部食管癌患者的全外顯子體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，從cBioPortal 網(wǎng)站（http：//www.cbioportal.org/）下載患者對應(yīng)的臨床資料，下載日期均為2017年9月20日。該臨床資料提供了利用蘇木精-伊紅對淋巴結(jié)進(jìn)行染色，通過鏡檢對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性進(jìn)行的計數(shù)，及其按照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）腫瘤淋巴結(jié)分期標(biāo)準(zhǔn)對患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的描述。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）疾病類型：食管鱗狀細(xì)胞癌；2）臨床資料完整：包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤位置和TNM分期等；3）可獲得對應(yīng)樣本的全外顯子體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）臨床資料中缺少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息；2）樣本對應(yīng)的基因變異類型為非體細(xì)胞突變。

1.3 臨床資料

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的食管鱗狀細(xì)胞癌共91 例，其中84例初始診斷時間為2009年～2013年，6例在2009年之前，1例不詳；男性77例（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例），女性14例（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，未發(fā)生淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移10例）；中位發(fā)病年齡58歲。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對患者進(jìn)行分組，對17項指標(biāo)進(jìn)行組間差異分析，其中包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤位置、T 分期、M 分期、蛋白質(zhì)編碼區(qū)突變數(shù)目，密碼子第一位、第二位、第三位突變數(shù)目，蛋白質(zhì)編碼區(qū)突變位點(diǎn)野生型堿基GC%，密碼子第一位、第二位、第三位突變位點(diǎn)野生型堿基GC%，蛋白質(zhì)編碼區(qū)突變位點(diǎn)突變型堿基GC%，密碼子第一位、第二、第三位突變位點(diǎn)突變型堿基GC%。

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Levene檢驗對計量資料進(jìn)行方差齊性檢驗，采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行組間單因素差異分析；采用Pearson χ2檢驗或Fisher 精確概率檢驗對計數(shù)資料進(jìn)行組間單因素差異分析。單因素分析具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)納入二元Logistic 回歸模型進(jìn)行多因素分析，采用條件概率逐步后退法建立模型，以消除交互影響，確定食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的獨(dú)立危險因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用ROC曲線和約登指數(shù)法確定最佳截斷值、靈敏度和特異性，通過ROC曲線下面積來評價影響因素的價值。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析

對17項指標(biāo)進(jìn)行單因素分析結(jié)果見表1，結(jié)果顯示發(fā)病年齡（t=2.087，P＜0.05）、密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平（t=2.542，P＜0.05）共2個指標(biāo)與食管鱗狀細(xì)胞癌是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其余指標(biāo)（性別、腫瘤位置、T 分期、M 分期、突變位點(diǎn)數(shù)目、蛋白質(zhì)編碼區(qū)及密碼子第二、三位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平、突變位點(diǎn)突變型堿基GC%水平）組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 單因素分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素 n（%）

表1 單因素分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素（續(xù)表1）

2.2 多因素分析

將患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組信息作為因變量，將單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的2 個指標(biāo)發(fā)病年齡和密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平作為協(xié)變量帶入二元Logistic 回歸模型，得到關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率的回歸方程：In［p/（1-p）］=-0.044X1-0.072X2+8.269。其分析結(jié)果如表2所示，顯示密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性［OR（95%CI）=0.931（0.874～0.991），P＜0.05］，是發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的保護(hù)因素。而發(fā)病年齡不能視為影響食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的因素。

表2 食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多因素Logistic回歸分析

2.3 密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評估價值

密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，其ROC 曲線下面積為0.639（P＜0.05，95%CI 為0.522～0.756），表明密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平對于食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有潛在診斷價值（圖1）。密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平的最大約登指數(shù)為0.277，由此確定該指標(biāo)的最佳截斷值為86.235%，對應(yīng)的敏感度和特異性分別為56.6%和71.1%。

圖1 密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平評估食管鱗狀細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線圖

3 討論

手術(shù)切除是食管鱗狀細(xì)胞癌的主要治療方法，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否是影響患者手術(shù)預(yù)后的重要因素［6-7］。目前可有效預(yù)測食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的分子標(biāo)記較少，并且大多為基因表達(dá)異常［3-4，8］，鮮見以基因組DNA突變?yōu)榉肿訕?biāo)記的報道。近年采用統(tǒng)計學(xué)方法篩選腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中顯著相關(guān)的指標(biāo)已成為研究熱點(diǎn)之一［9-10］。本研究通過對符合納入標(biāo)準(zhǔn)的91例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的全外顯子組體細(xì)胞突變進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸密碼子第一位突變時，發(fā)生突變位置的野生型堿基GC%水平與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05），并對預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險具有潛在價值。本研究結(jié)果提示密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平越高的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越低。

氨基酸密碼子不同位置發(fā)生突變對其編碼的蛋白質(zhì)影響不同，密碼子的第三位堿基突變不影響其編碼的氨基酸，密碼子第二位的堿基突變可能會導(dǎo)致其編碼氨基酸的理化性質(zhì)發(fā)生變化，密碼子第一位堿基突變對氨基酸變化的影響比第二位的更加重要［11］。所以將食管鱗狀細(xì)胞癌的體細(xì)胞突變按照密碼子位置不同進(jìn)行分類，進(jìn)而對不同位置上的突變進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，有助于深入探索突變在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的差異。本研究結(jié)果中密碼子第一位突變點(diǎn)的野生型堿基GC%水平組間差異，可能源于腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的選擇壓力。Jiang 等［12］提出人類基因突變具有方向性，并且在外顯子組中G：C→A：T突變的頻率最高，揭示了人類基因組中G/C野生型堿基更容易發(fā)生突變，導(dǎo)致發(fā)生突變區(qū)域堿基A/T比例增大。本研究結(jié)果中密碼子第二、三位突變位點(diǎn)的野生型堿基的GC%水平在組間無顯著性差異，可能是密碼子不同位置受到的選擇壓力不同導(dǎo)致。密碼子各個突變位置的突變型堿基GC%水平，均未發(fā)現(xiàn)組間差異。

GC%是基因組DNA 的重要指標(biāo)，通常具有區(qū)域性變化的特點(diǎn)，其可以通過影響蛋白質(zhì)編碼和調(diào)控基因表達(dá)來影響細(xì)胞功能。Figuet 等［13］對44 種脊椎動物密碼子第三位GC%進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果表明編碼區(qū)GC%含量與核型特征相關(guān)，提示該指標(biāo)可作為堿基組成動態(tài)進(jìn)化的標(biāo)記并最終影響蛋白質(zhì)的進(jìn)化。Chen 等［14］通過構(gòu)建利用GC 含量等指標(biāo)預(yù)測基因編碼區(qū)點(diǎn)突變率的統(tǒng)計模型，闡述了基因突變、GC含量與基因表達(dá)水平的相關(guān)性。本研究通過單因素分析和多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)密碼子第一位突變點(diǎn)野生型堿基GC%水平與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是其保護(hù)因素，提示該區(qū)域具有較高的GC%水平時患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較低。ROC 曲線表明該指標(biāo)具有潛在的臨床應(yīng)用價值，但其曲線下面積、敏感度、特異性等指標(biāo)均有可優(yōu)化的空間，在后續(xù)研究中可能從以下方面進(jìn)行優(yōu)化：1）排除非相關(guān)因素干擾：將突變范圍縮減至癌癥相關(guān)基因或食管癌相關(guān)基因的編碼區(qū)；2）增加樣本量：建立驗證隊列并對結(jié)論的穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

不同的淋巴結(jié)清掃范圍會有不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，為探明受檢淋巴結(jié)范圍影響，按照本研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和陰性對患者進(jìn)行分組，比較組間受檢淋巴結(jié)數(shù)目差異。Levene 檢驗結(jié)果顯示組間數(shù)據(jù)方差齊，獨(dú)立樣本t檢驗結(jié)果顯示組間受檢淋巴結(jié)數(shù)目無差異（t=-0.903，P＞0.05）。該結(jié)果表明本研究中受檢淋巴結(jié)數(shù)目在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和陰性患者組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制比較復(fù)雜，與基因突變［15］、基因表達(dá)水平變化［16］、基因甲基化［17］等多種變異類型有關(guān)。本研究結(jié)果為食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移研究提供了新思路，并為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測提供了新的潛在分子標(biāo)記。