吳正財(cái) 王成艷 吳香新 許昌聲 林敏輝

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）為一種高度異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多種基因改變，核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）突變?yōu)樗柘蛋籽。╩yeloid leukemia，ML）最常見(jiàn)的基因突變，其NPM1 A 型突變體（NPM1 mutant A，NPM1 A）約占75%～80%［1-2］。研究證實(shí)，NPM1突變可下調(diào)抑癌蛋白ARF 的活性、增強(qiáng)癌蛋白c-myc 的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖［3-5］；動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NPM1 突變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓組織異常增生［6］。研究發(fā)現(xiàn)，NPM1 突變后可促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞信號(hào)分子PI3K、ARF 和NF-kappa B 等發(fā)生移位，參與調(diào)控白血病細(xì)胞的惡性增殖和抵抗凋亡［4-7］。AKT為細(xì)胞增殖的重要調(diào)控分子，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1 作用下，發(fā)生磷酸化及細(xì)胞核移位，刺激下游信號(hào)分子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［8］。研究發(fā)現(xiàn)，AML患者白血病細(xì)胞過(guò)度增殖與AKT 分子磷酸化有關(guān)［9］。本研究通過(guò)體外感染攜帶NPM1 A 型突變體腺病病毒（Ad5－NPM1）K562細(xì)胞，觀察Ad5-NPM1 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的K562 細(xì)胞增殖及AKT磷酸化的影響，探討過(guò)表達(dá)NPM1突變蛋白的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 Ad5-NPM1-EGFP 腺病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；TGF-β1 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；anti-NPM1 和anti-βactin 抗體及免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；anti-AKT 和anti-P-AKT 購(gòu)自美國(guó)TSC公司；HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NPM1 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海Roche 公司。SW-CJ－IF 型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇凈集團(tuán)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo 公司；超速低溫離心機(jī)Sigma-3K15 購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；-70℃超低溫冰箱DW-86L386 購(gòu)自青島海爾集團(tuán)；Ⅸ70 型熒光相差倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；Mini-PROTEAN Tetra MP4 垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；DYCP-40C 型半干式碳板轉(zhuǎn)印儀槽購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 白血病細(xì)胞株K562由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所提供，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d 將細(xì)胞培養(yǎng)液移至15 mL 離心管，300 g離心，棄上清，加10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)重懸細(xì)胞，按1∶3分裝培養(yǎng)，取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 法測(cè)細(xì)胞上清液NPM1 蛋白含量 準(zhǔn)備好稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，按Roche NPM1 ELISA 試劑盒說(shuō)明書完成操作，于450 nm 處測(cè)定OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算待測(cè)樣品濃度。

1.2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖 取3～5代K562細(xì)胞，300 g離心，0.2%FBS 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞2×105cells/mL，接96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞分為3 組：空白對(duì)照組（CT）、空載組（轉(zhuǎn)染Ad5-vector-100）、Ad5-NPM1 組，每組3 個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染3 d 后加入TGF-β1干預(yù)24 h；干預(yù)完成后加入10μL/孔MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，300 g離心，棄上清，加入DMSO 100μL/孔，置搖床上低速振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定OD值。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取3～5代K562細(xì)胞300 g離心，0.2%FBS 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞2×105cells/mL，均勻接種于6 孔板中，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入不同處理因素（TGF-β1 或轉(zhuǎn)染NPM1 聯(lián)合處理）后，反復(fù)吹打細(xì)胞培養(yǎng)基數(shù)次，將細(xì)胞懸液移至1.5 mL EP管，300 g離心10 min，棄上清液，加1×SDS（200μL/管）混勻，冰上靜置10 min，收集混合液于EP 管中，迅速置于沸水中10 min。4℃，12 000 g離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白含量后，經(jīng)10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜。用TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，洗膜后，滴加Luminol發(fā)光液，顯影，定影，掃描，White/Ultraviolet Transilluminator 凝膠成像系統(tǒng)分析，蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與β-actin光密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料以表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒載體Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞后熒光強(qiáng)度的變化

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，K562 細(xì)胞胞質(zhì)熒光強(qiáng)度隨重組腺病毒載體Ad5-NPM1 感染復(fù)數(shù)（MOI：30～200）增加而增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染第3 d后可見(jiàn)K562細(xì)胞胞質(zhì)有大量綠色熒光（圖1）。

2.2 Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞（3 d）后NPM1 蛋白表達(dá)水平的變化

Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（3 d）后提取蛋白，進(jìn)行Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）之間NPM1蛋白水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；NPM1蛋白表達(dá)水平呈Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI：30～100）依賴性增加，與Ad5-vector-100組相比，Ad5-NPM1-30組和Ad5-NPM1-100組NPM1蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.01），Ad5-NPM1-200組和Ad5-NPM1-100組NPM1表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖2）。后續(xù)選擇Ad5-NPM1-100為實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（3天）后細(xì)胞上清液NPM1蛋白含量的變化

為進(jìn)一步測(cè)定感染效率，本研究提取細(xì)胞上清液行NPM1 ELISA實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）NPM1蛋白含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；K562細(xì)胞上清液的NPM1水平呈Ad-NPM1轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)依賴性增加（r=0.92），與CT組相比，Ad-NPM1-30組和Ad-NPM1-100組的NPM1蛋白含量顯著增加（P＜0.01），Ad-NPM1-200組和Ad-NPM1-100組NPM1蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖1 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（3 d）熒光顯微鏡觀察（物鏡×10）

圖2 Western blot檢測(cè)Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（3 d）NPM1蛋白表達(dá)

圖3 ELISA法測(cè)Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞上清液NPM1蛋白含量

2.4 TGF-β1（10 ng/mL）對(duì)K562 細(xì)胞AKT、P-AKT水平的影響

Western blot 法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠時(shí)間依賴性誘導(dǎo)K562細(xì)胞AKT 蛋白磷酸化，其磷酸化水平在作用30 min 后即明顯增加，45 min 達(dá)到峰點(diǎn)，但對(duì)總AKT水平無(wú)顯著影響（圖4）。

2.5 Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的K562 細(xì)胞AKT、P-AKT的影響

K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）處理45 min，提取蛋白進(jìn)行Western blot法檢測(cè)。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組（CT）相比，TGFβ1刺激可顯著增加K562細(xì)胞的P-AKT水平；與TGFβ1（10 ng/mL）組相比，TGF-β1+Ad5-Vector-100組PAKT水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TGF-β1+Ad5-NPM1-100組的P-AKT水平則顯著增加（P＜0.05），各組總AKT水平未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05，圖5）。

圖4 Western blot 法檢測(cè)TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo)K562細(xì)胞AKT、PAKT的影響

2.6 Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的K562細(xì)胞增殖的影響

K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）處理24 h，行MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示空白對(duì)照組（CT）與空載組（Ad5-vector-100）間細(xì)胞增殖無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與Ad5-vector-100組相比，TGF-β1+Ad5-vector-100 組細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.01）；TGF-β1+Ad5-NPM1-100組細(xì)胞增殖顯著高于TGF-β1+Ad5-vector-100組（P＜0.01，圖6）。

圖5 Western blot 法檢測(cè)Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo)K562細(xì)胞AKT、P-AKT的影響

3 討論

NPM1為一種重要的核磷蛋白，其參與多種細(xì)胞生物過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPM1 突變體蛋白可下調(diào)抑癌蛋白ARF 的活性、增強(qiáng)癌蛋白c-myc 的穩(wěn)定性，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞刺激因子反應(yīng)性，促進(jìn)細(xì)胞的過(guò)度增殖［4］。Falini 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在AML 患者中常伴有NPM1 突變，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)伴有NPM1 突變體白血病細(xì)胞對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)增殖能力明顯增強(qiáng)，PI3K/AKT信號(hào)通路活性也顯著升高，提示患有NPM1突變的白血病患者可能通過(guò)增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖效應(yīng)。本研究旨在探究NPM1突變?cè)谏L(zhǎng)因子作用下對(duì)ML 細(xì)胞株K562 增殖的影響。首先將攜帶NPM1 A 型突變體的腺病毒載體轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞建立過(guò)表達(dá)NPM1 蛋白的K562 細(xì)胞株。Western blot 與ELISA 的檢測(cè)結(jié)果均顯示，Ad5-NPM1轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞3 d后細(xì)胞NPM1蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示通過(guò)攜帶NPM1A 型突變體基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染可成功建立過(guò)表達(dá)NPM1蛋白的K562細(xì)胞株。

圖6 MTT 法檢測(cè)Ad5-NPM1 轉(zhuǎn)染（MOI=100）對(duì)TGF-β1（10 ng/mL）K562細(xì)胞增殖的影響

TGF-β1為一種重要腫瘤細(xì)胞刺激分子，其可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，Hamilton 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，AKT 作為細(xì)胞增殖重要調(diào)控分子，在生長(zhǎng)因子作用下，AKT發(fā)生磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)。本研究采用10 ng/mL的TGF-β1短時(shí)間處理K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1能有效增加AKT 的磷酸化水平，結(jié)果提示在K562細(xì)胞中TGF-β1 可能通過(guò)調(diào)控AKT 磷酸化水平來(lái)誘導(dǎo)生長(zhǎng)。隨即檢測(cè)過(guò)表達(dá)NPM1 蛋白K562 細(xì)胞株中，過(guò)表達(dá)NPM1 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)P-AKT 的影響，發(fā)現(xiàn)與TGF-β1（10 ng/mL）組相比，轉(zhuǎn)染Ad5-NPM1 的K562細(xì)胞能進(jìn)一步增加TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo)的AKT磷酸化水平。MTT 結(jié)果也顯示過(guò)表達(dá)NPM1 蛋白可明顯促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的K562細(xì)胞增殖。

綜上所述，NPM1 A 型突變體可增強(qiáng)TGF-β1 對(duì)K562 細(xì)胞誘導(dǎo)的增殖能力，且與AKT 磷酸化水平有關(guān)。