李曉娟 李浩 馬永壯 閆吉元 張俊 馬天 劉朝旭 楊勇 任曄 吳華

軟骨組織是一種特殊形式的結(jié)締組織，不含神經(jīng)纖維、血管及淋巴管，并受各種內(nèi)分泌、旁分泌激素及復(fù)雜的局部信號(hào)環(huán)路的調(diào)控［1］。氧是細(xì)胞新陳代謝的重要能量來(lái)源，組織中所需要的氧主要依靠血管運(yùn)輸。由于軟骨組織無(wú)血管，因此在軟骨組織中氧分壓較其他組織低，在生理?xiàng)l件下軟骨細(xì)胞對(duì)低氧表現(xiàn)出良好的適應(yīng)能力。然而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中難以保持其表型的穩(wěn)定性而出現(xiàn)包括成纖維樣改變、細(xì)胞外基質(zhì)成分的大量丟失等［2］，從而給軟骨細(xì)胞的研究帶來(lái)了很大的困難，這也是軟骨組織工程中自體軟骨移植應(yīng)用的主要缺點(diǎn)之一。其中生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中如何維持正常的生理功能，及其涉及信號(hào)通路尚未完全明了。

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor?1,HIF?1）是由氧調(diào)節(jié)性的α亞基和恒定表達(dá)的β亞基組成的轉(zhuǎn)錄因子。HIF?1α是軟骨細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)中重要的介導(dǎo)因子，并可上調(diào)一系列細(xì)胞因子從而介導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化、增殖、遷徙等，其中包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)維持軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和功能具有重要意義［3］。

Yes相關(guān)蛋白（Yes?associated protein,YAP）是組織穩(wěn)態(tài)、器官發(fā)育和腫瘤形成的核心調(diào)控因子。當(dāng)經(jīng)典的Hippo信號(hào)被激活，哺乳動(dòng)物Ste20類(lèi)似蛋白激酶 1/2（mammalian Ste20 like protein kinase1/2，MST1/2）被磷酸化并與salvador相互作用磷酸化大腫瘤抑制同源體（large tumor suppressor homologue,LATS1/2）激酶，磷酸化的LATS1/2激酶被激活，激活后的LATS1/2激酶磷酸化下游的YAP致使YAP失活。磷酸化Yes相關(guān)蛋白（p?Yes?associated protein，P?YAP）與14?3?3結(jié)合并被蛋白酶體泛素化降解。去磷酸化的YAP入核并主要與TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（TEAD）家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)［4，5］。YAP1是軟骨祖細(xì)胞增殖和維持所必須的，并能夠促進(jìn)早期軟骨細(xì)胞的增殖［6］。YAP1可通過(guò)抑制Ⅹ型膠原α鏈（Collagen10α1,Col10α1）表達(dá)和與 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（runt?related transcription factor 2,Runx2）相互作用從而抑制軟骨細(xì)胞肥大。但是，YAP在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞缺氧條件中的作用尚有爭(zhēng)議。

考慮到Y(jié)AP參與軟骨細(xì)胞的發(fā)育、分化，我們猜測(cè)YAP可能通過(guò)與HIF?1α相互作用從而參與缺氧條件下軟骨細(xì)胞的分化。在此研究中，我們利用氯化鈷干預(yù)以模擬體外缺氧微環(huán)境，探索在體外實(shí)驗(yàn)中氯化鈷模擬的缺氧微環(huán)境是否能夠促進(jìn)YAP的激活，并且是否能夠促進(jìn)軟骨表型的維持。進(jìn)一步探索體外實(shí)驗(yàn)中氯化鈷模擬的缺氧微環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞的影響作用中YAP與HIF?1α之間的關(guān)系。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)試劑、材料和設(shè)備

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，武漢博士德公司，中國(guó)），胰酶（Gibco，美國(guó)），二型膠原酶（Invitrogen，美國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，美國(guó)），青鏈霉素（100 U/ml penicillin G sodium，100 μg/ml streptomycinsulfate，Gibco，美國(guó)），Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F?12（DMEM/F?12，HyClone，美國(guó)），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK?8，武漢博士德公司，中國(guó)），氯化鈷（Thermo Fisher，美國(guó)），成軟骨培養(yǎng)基（賽業(yè)公司，美國(guó)），HIF?1αsiRNA（廣州銳博公司，中國(guó)），lipo2000（Thermo Fisher，美國(guó)），Opti?MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），蛋白酶抑制劑（武漢博士德公司，中國(guó)），磷酸酶抑制劑（武漢博士德公司，中國(guó)），RIPA裂解液（武漢博士德公司，中國(guó)），硝酸纖維素薄膜（polyvinylidene fluo?ride，PVDF，Millipore，Billerica，美國(guó)），ECL發(fā)光液（Thermo Pierce，美國(guó)），培養(yǎng)箱（21%O2，74%N2，5%CO2，飽和濕度，Thormo公司，美國(guó)），Bio?Rad曝光機(jī)（Hercules，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Eppendorf公司，德國(guó)），抗體：YAP（#14074，Cell Signaling Technology，美國(guó)），Ⅱ型膠原（Collagen 2,Col2）（ab34712，Abcam，英國(guó)），HIF?1α（ab2185，Abcam，英國(guó)），β?actin（BM5180，武漢博士德公司，中國(guó)）。

二、分離和培養(yǎng)軟骨細(xì)胞

生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞取自7日齡的SD大鼠。所有動(dòng)物規(guī)程遵從我院倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。SD大鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，軟骨取自股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端生長(zhǎng)板軟骨組織，用PBS漂洗后切碎至1～3 mm3大小，用0.25%胰酶消化30 min，隨后用0.1%二型膠原酶37℃消化8 h。PBS漂洗后離心收集細(xì)胞，并用含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM/F?12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后種入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，胰酶消化傳代，第3代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

三、氯化鈷干預(yù)形成缺氧環(huán)境

首先將軟骨細(xì)胞（5 000細(xì)胞/孔）接種到96孔板中。細(xì)胞黏附24 h后，用不同濃度的氯化鈷培養(yǎng)基（0、50、100、150、200 μmol/L）處理細(xì)胞24 h。

（一）細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)使用CCK?8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒分析細(xì)胞活力。細(xì)胞干預(yù)完成后，在每孔中加入100 μl培養(yǎng)基和10 μl的CCK?8溶液。在37 ℃下再溫育1 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的吸光度。

（二）阿利新藍(lán)染色

將2×106個(gè)大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞重懸于10 μl的培養(yǎng)基中，隨后將其種入6孔板中，放置培養(yǎng)箱中稍稍干燥后按分組加入2 ml培養(yǎng)基：①對(duì)照組：普通培養(yǎng)基；②成軟骨培養(yǎng)基組：成軟骨培養(yǎng)基；③氯化鈷干預(yù)組：氯化鈷濃度為10-5mol/L的普通培養(yǎng)基；④成軟骨培養(yǎng)基+氯化鈷組：含10-5mol/L氯化鈷的成軟骨培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)7 d后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。

（三）Western blotting

1.濃度梯度實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞干預(yù)完成后進(jìn)行West?ern blotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達(dá)。干預(yù)后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS漂洗后，用含1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解軟骨細(xì)胞30 min，12 000 r/min，4℃離心，收集上清后用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h后用相應(yīng)抗體4℃孵育過(guò)夜。三乙醇胺緩沖鹽+Tweenzo溶液（tris?buffered saline and tween 20,TBST）洗漂洗后室溫下孵育辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗1 h，再次TBST漂洗后應(yīng)用ECL發(fā)光液，Bio?Rad曝光機(jī)下曝光。β?actin作為內(nèi)參。

2.時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳濃度的氯化鈷培養(yǎng)基干預(yù)軟骨細(xì)胞不同的時(shí)間梯度（0、12、24、36和48 h），然后進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，測(cè)量Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達(dá)，方法同上。

3.siRNA干預(yù) 當(dāng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞融合達(dá)50%左右時(shí)棄原培養(yǎng)基，加入2 ml含50 nmol/L HIF?1αsiRNA（或 50 nmol/L YAP siRNA）和 lipo2000的Opti?MEM培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染6 h。轉(zhuǎn)染完成后，用100 μmol/L氯化鈷干預(yù)24 h，測(cè)量Col2、YAP和HIF?1α蛋白的表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件（IBM公司，美國(guó)），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用檢驗(yàn)One?wayANOVA，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、氯化鈷對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性檢測(cè)

如圖1所示，CCK?8結(jié)果顯示不同濃度的氯化鈷（50、100、150、200 μmol/L）對(duì)軟骨細(xì)胞活性并沒(méi)有明顯的影響。

圖1 氯化鈷對(duì)軟骨細(xì)胞細(xì)胞活性作用

圖2 氯化鈷促進(jìn)大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)

二、軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成

如圖2所示，根據(jù)軟骨細(xì)胞微團(tuán)大小可以發(fā)現(xiàn)，各組中軟骨細(xì)胞微團(tuán)均被染成藍(lán)色；氯化鈷培養(yǎng)基組微團(tuán)大小較對(duì)照組明顯增加。結(jié)果提示，氯化鈷模擬的體外缺氧環(huán)境能夠促進(jìn)大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

三、成軟骨特異性標(biāo)志物的表達(dá)

圖3的Western blotting結(jié)果顯示，氯化鈷能夠明顯上調(diào)軟骨細(xì)胞中Col2蛋白水平的表達(dá)，且濃度為100 μmol/L時(shí)效果最為明顯。因此我們隨后應(yīng)用濃度為100 μmol/L的氯化鈷刺激軟骨細(xì)胞不同的時(shí)間長(zhǎng)度（0、12、24、36、48 h），并用Western blotting方法再次檢測(cè)Col2的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，100 μmol/L的氯化鈷能夠有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞中Col2蛋白水平表達(dá)，并且呈時(shí)間依耐性。

四、大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞HIF?1α和YAP的表達(dá)

圖3的Western blotting結(jié)果顯示，在應(yīng)用不同濃度的氯化鈷刺激后，YAP蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，且在100 μmol/L濃度時(shí)最為明顯，但是當(dāng)氯化鈷濃度達(dá)200 μmol/L時(shí)YAP的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)。HIF?1α的表達(dá)水平變化同YAP一致。

應(yīng)用100 μmol/L氯化鈷刺激后，YAP蛋白上調(diào)明顯，于24 h時(shí)到達(dá)頂峰，隨后表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)。HIF?1α蛋白表達(dá)變化與YAP保持高度一致。

五、HIF?1/YAP信號(hào)參與促進(jìn)軟骨細(xì)胞表型維持

應(yīng)用siRNA下調(diào)氯化鈷刺激下大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中HIF?1α表達(dá)后，圖4 Western blotting結(jié)果顯示，下調(diào)HIF?1α后，YAP表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，并且Col2表達(dá)水平同樣出現(xiàn)了下調(diào)。隨后我們應(yīng)用siRNA下調(diào)YAP表達(dá)后檢測(cè)HIF?1α蛋白水平變化發(fā)現(xiàn)，下調(diào)YAP的表達(dá)對(duì)HIF?1α蛋白水平的表達(dá)并無(wú)明顯影響。結(jié)果說(shuō)明，缺氧促進(jìn)的大鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞表型維持中，HIF?1α可能位于YAP的上游。

討 論

圖3 氯化鈷上調(diào)軟骨細(xì)胞Col2、HIF?1α和YAP蛋白的表達(dá)

圖4 氯化鈷通過(guò)HIF?1α/YAP信號(hào)促進(jìn)軟骨細(xì)胞表型維持

軟骨組織中只含有軟骨細(xì)胞這一種組織細(xì)胞類(lèi)型，其所需的氧主要來(lái)源于滑液。軟骨細(xì)胞可以產(chǎn)生維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)平衡所需的物質(zhì)，包括膠原（主要為Col2）和蛋白多糖（主要為聚集蛋白多糖）。研究表明，在體內(nèi)軟骨細(xì)胞長(zhǎng)期處于低氧微環(huán)境中，于體外培養(yǎng)時(shí)多處于相對(duì)于其生理狀態(tài)下的高氧環(huán)境中，多次傳代后軟骨細(xì)胞形態(tài)會(huì)出現(xiàn)改變，同時(shí)丟失軟骨特性型標(biāo)記物。因此，研究軟骨細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中的細(xì)胞反應(yīng)對(duì)研究軟骨細(xì)胞的生理功能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中我們利用氯化鈷干預(yù)軟骨細(xì)胞以模擬體外的缺氧微環(huán)境。

HIF是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一類(lèi)介導(dǎo)低氧適應(yīng)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由氧調(diào)節(jié)性的α亞基和恒定表達(dá)的β亞基組成的轉(zhuǎn)錄因子。HIF?α為功能性亞基，決定HIF的活性，受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)［3］。HIF?β為結(jié)構(gòu)性亞基，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，不受氧濃度的影響和調(diào)節(jié)。在常氧條件下，HIF?α與VHL（Von Hippel?Lindau）蛋白結(jié)合，并被泛素連接酶E3受體識(shí)別，形成E3泛素連接酶復(fù)合物從而被泛素化降解。當(dāng)氧濃度降低時(shí)，HIF?α通過(guò)抑制HIF抑制因子或與脯氨酸羥化酶作用增加穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，并與HIF?β形成二聚體結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)［3］。HIF?1在軟骨正常生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、存活過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用［7?9］。常氧條件下Co2+能夠穩(wěn)定HIF?1α活性并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)［10］。在此研究中我們應(yīng)用不同濃度的氯化鈷干預(yù)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，HIF?1α蛋白表達(dá)水平上調(diào)。且100 μmol/L氯化鈷刺激軟骨細(xì)胞不同的時(shí)間長(zhǎng)度后發(fā)現(xiàn)，HIF?1α蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。說(shuō)明了常氧條件下Co2+除了能夠有效地穩(wěn)定HIF?1α活性，并且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。細(xì)胞缺氧狀態(tài)下，HIF?1α在能量供應(yīng)、紅細(xì)胞生成、血管再生及細(xì)胞存活等方面發(fā)揮重要作用。體外的病理性缺氧能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞（neu?ral stem cell，NSC）的增殖，并上調(diào)HIF?1α表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路。沉默HIF?1α可降低β?catenin的核轉(zhuǎn)位和cyclinD1的表達(dá)，并抑制NSC的增殖［11］。于體外培養(yǎng)中敲除生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞HIF?1α基因時(shí)，軟骨細(xì)胞增殖能力明顯減弱并出現(xiàn)大量死亡［12，13］。于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中特異性敲除軟骨細(xì)胞內(nèi)HIF?1α基因時(shí)，軟骨細(xì)胞不能維持正常的代謝功能，胎鼠因?yàn)橹夤芩莺屠吖前l(fā)育畸形出現(xiàn)呼吸功能障礙而于出生前死亡［14］。當(dāng)肢芽間充質(zhì)干細(xì)胞缺乏HIF?1α可導(dǎo)致軟骨組織形成延遲［13，15］。HIF?1α能夠抑制缺氧環(huán)境下終板軟骨細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)終板軟骨細(xì)胞起到保護(hù)作用。缺氧環(huán)境能通過(guò)HIF?1α促進(jìn)Col2、蛋白多糖的表達(dá)從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成代謝［16］。在此實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)我們利用氯化鈷上調(diào)常氧條件下HIF?1α的表達(dá)時(shí)，Col2的表達(dá)也相應(yīng)的出現(xiàn)了上調(diào)。這似乎表明缺氧所致Col2的上調(diào)與缺氧條件下HIF?1α的激活有關(guān)。且有研究表明，體外培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞予以缺氧或者HIF?1α刺激時(shí)，Col2、蛋白多糖表達(dá)增加，Col10合成減少。當(dāng)去除HIF?1α刺激時(shí)Col2、蛋白多糖表達(dá)下降，Col10合成增加［17］。并且在軟骨炎中，HIF?1α能夠保護(hù)軟骨細(xì)胞免受炎性因子的攻擊［18］。

Hippo信號(hào)通路在許多的器官中起到控制器官的大小和組織再生的作用，并具有調(diào)控細(xì)胞的增殖分化等作用［4，19］。YAP被證實(shí)參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程，包括機(jī)械力傳導(dǎo)［20］，干細(xì)胞分化［21］等。但Hippo信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞分化和骨修復(fù)中的作用仍然不甚明了。YAP1作為Hippo信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠直接調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y型高遷移率族蛋白 6（sex?determining region Y?type high mobility group box protein6，SOX6）的表達(dá)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，Teads是YAP1結(jié)合DNA所必須的轉(zhuǎn)錄因子，YAP1/Teads復(fù)合體直接誘導(dǎo)SOX6的表達(dá)，并且Teads與YAP1的結(jié)合是YAP1調(diào)控SOX6表達(dá)所必須的，從而YAP1介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖其中一部分是通過(guò)SOX6傳導(dǎo)的［6］，并通過(guò)與Runx2的相互作用抑制Col10α1的表達(dá)而抑制軟骨細(xì)胞成熟［22］。在胎鼠的生長(zhǎng)板軟骨中YAP1在靜息層和增殖層表達(dá)明顯，而P?YAP1在肥大層表達(dá)明顯，并且肥大層中Col10α1和Runx2表達(dá)明顯。YAP1可抑制骨骼發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中的軟骨細(xì)胞成熟及軟骨內(nèi)成骨。YAP1是軟骨祖細(xì)胞增殖和維持所必須的。YAP1的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖能力但是會(huì)抑制其分化，并且YAP1過(guò)表達(dá)能夠激活Wnt/β?catenin信號(hào)通路，Dickkopf?1和β?catenin siRNA可部分減弱YAP1過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5細(xì)胞分化的影響，因此YAP1在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cell，MSCs）成軟骨分化過(guò)程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，下調(diào)YAP的表達(dá)有助于MSCs成軟骨分化［23］。但關(guān)于缺氧與YAP之間相互作用的研究較少，尤其是關(guān)于在軟骨細(xì)胞中缺氧與YAP之間相互作用的報(bào)道尚未見(jiàn)到。有研究表明缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系HEK293T，HeLa和MDA?MB?231中YAP磷酸化并下調(diào)總YAP的表達(dá)［24］。而在另外一份研究中表明缺氧能夠使Hippo信號(hào)失活，YAP表達(dá)上調(diào)并與HIF?1α形成復(fù)合物，從而穩(wěn)定HIF?1α在體內(nèi)腫瘤中的表達(dá)［25］。在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中干擾YAP顯著下調(diào)HIF?1蛋白質(zhì)表達(dá)［26］。在前列腺癌中缺氧可通過(guò)增減細(xì)胞核中YAP表達(dá)和抑制P?YAP水平來(lái)提高YAP的活性［27］。

在此研究中，我們利用HIF?1α的激動(dòng)劑氯化鈷于常氧條件下刺激軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，氯化鈷能夠有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。并且利用不同濃度氯化鈷刺激軟骨細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞內(nèi)Col2表達(dá)明顯上調(diào)，并且這種上調(diào)呈時(shí)間和濃度依耐性。氯化鈷同時(shí)能夠上調(diào)軟骨細(xì)胞中YAP的表達(dá)，且具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。當(dāng)氯化鈷濃度超過(guò)一定值或者干預(yù)超過(guò)一定時(shí)間長(zhǎng)度時(shí)，這種促進(jìn)作用出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。與此同時(shí)，當(dāng)下調(diào)HIF?1α的表達(dá)后氯化鈷促進(jìn)YAP表達(dá)的上調(diào)出現(xiàn)減弱。因此我們推測(cè)氯化鈷模擬的缺氧環(huán)境能夠通過(guò)HIF?1α/YAP信號(hào)促進(jìn)軟骨細(xì)胞軟骨表型的維持。但具體為哪種亞型軟骨細(xì)胞在此過(guò)程中起到主導(dǎo)作用有待進(jìn)一步細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

氯化鈷能夠促進(jìn)YAP的激活，并且是HIF?1α依賴(lài)性的，下調(diào)HIF?1α的表達(dá)能夠抑制氯化鈷所致的YAP的激活和軟骨細(xì)胞表型的維持。最重要的是，我們的研究表明缺氧環(huán)境通過(guò)HIF?1α和YAP之間相互作用從而最終影響軟骨細(xì)胞表型的維持。這也許可為軟骨組織工程中軟骨細(xì)胞制備提供一個(gè)新的思路或靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)存在缺乏對(duì)HIF?1α和YAP結(jié)合位點(diǎn)研究，及缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分等眾多不足。