趙富生，武庚★，張曉莉，張際緋，石學(xué)魁，劉志新，李玉婷，趙曉翔，戴安

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000；2.西雙版納州人民醫(yī)院，云南 西雙版納 666100）

0 引言

糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015 年全球約有4.15 億人罹患糖尿病，預(yù)計(jì)到2040 年全世界糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到6.42 億[1]。統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)成年人糖尿病患病率高達(dá)11.6%，如據(jù)此推算，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)達(dá)1.1 億，成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家[2,3]。糖尿病足是一種常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，由血糖代謝紊亂而引起的局部神經(jīng)異常和下肢肢端血管病變，臨床表現(xiàn)為足部局部組織感染和潰瘍，是導(dǎo)致患者致殘和死亡的重要原因之一[4]。研究資料顯示，在我國(guó)糖尿病足約占門(mén)診糖尿病患者的2%，占住院糖尿病患者的12.4%[5]。目前，盡管中西醫(yī)綜合治療可緩解糖尿病足癥狀，但遠(yuǎn)期療效并不明顯。人胎盤(pán)又稱(chēng)紫河車(chē)，據(jù)《本草綱目》記載“紫河車(chē)味苦、咸、性溫”，具有“安神、補(bǔ)氣、益精、解毒、補(bǔ)氣之功效”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，胎盤(pán)提取物具有防止粘連、減輕疼痛和促進(jìn)上皮愈合的作用[6]。本研究通過(guò)觀察胎盤(pán)粉外敷對(duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響，旨在尋找治療糖尿病皮膚潰瘍的有效方法。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)1 月齡SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質(zhì)量90～120 g，自由食水，室溫(20±2)℃條件下普通飼料分籠喂養(yǎng)，晝夜12 h 交替光照。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（黑）2012-010，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑和儀器

紫河車(chē)膠囊（北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司）；ICAM-1 兔抗大鼠單克隆抗體（Abcam 公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；體式顯微鏡（SMZ745 型，Nikon公司）；酶標(biāo)儀（2013A70D，Thermo Fisher 公司）；高壓蒸汽消毒鍋（GYZ-2000 型，上海博訊實(shí)業(yè)公司）；電子分析天平（A2104 型，上海方瑞儀器廠）。

2 方法

2.1 建模及實(shí)驗(yàn)分組

建模前大鼠禁食12h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，60mg/kg）誘發(fā)糖尿病，注射3d 后，尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖水平，并觀察大鼠體重變化。大鼠空腹血糖＞16.7mmol/L 時(shí)，認(rèn)為糖尿病模型制備成功[7]。本研究中20 只大鼠制備糖尿病模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為模型組（B 組）和治療組（C 組），每組10 只大鼠。選取10 只正常大鼠為對(duì)照組（A 組）。

2.2 皮膚潰瘍制備及干預(yù)

用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉各組大鼠，常規(guī)消毒后，在大鼠脊柱腰背部?jī)蓚?cè)標(biāo)記直徑為2.0cm 的圓形圖案，用手術(shù)剪沿著標(biāo)記線剪去全層皮膚和皮下組織，止血后用無(wú)菌紗布包扎，次日起每日用50% 冰醋酸涂抹創(chuàng)面，制備皮膚缺損潰瘍模型。潰瘍形成后，A 組和B 組用生理鹽水清洗后包扎處理，每日1 次；C 組用生理鹽水清洗潰瘍后外敷胎盤(pán)粉包扎，每日處理1 次。

2.3 潰瘍創(chuàng)面愈合評(píng)價(jià)

潰瘍制備第0、2、4、6、8、10、12、14d 測(cè)量各組大鼠皮膚潰瘍面積。具體方法如下：將透明薄膜覆蓋在潰瘍表面，用記號(hào)筆將潰瘍輪廓勾畫(huà)在透明薄膜上，取下透明薄膜，測(cè)量最長(zhǎng)和最短直徑后求平均值，計(jì)算潰瘍面積。

2.4 炎性細(xì)胞因子含量檢測(cè)

潰瘍制備第14d，乙醚麻醉后處死各組大鼠，切取潰瘍與正常皮膚交界處組織勻漿取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒的操作說(shuō)明，測(cè)定各組大鼠潰瘍組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18的含量。

2.5 細(xì)胞間黏附分子-1 蛋白表達(dá)檢測(cè)

潰瘍制備第14d，麻醉處死各組大鼠，切取潰瘍與正常皮膚交界處組織，加入裂解液研磨，4℃、12000r/min 離心，取上清液，采用BCA 法測(cè)定蛋白含量。取適量上清液于沸水中煮5min 變性，經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，置于5%脫脂奶粉溶液封閉2h，滴加TBST 稀釋的兔抗大鼠細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日TBST 漂洗PVDF膜3 次，滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2h，TBST 漂洗膜3 次，使用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光劑（ECL）顯影，凝膠成像，采用Quantity One 軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示。多組間比較采用單因素方差分析。兩組之間比較使用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD）。P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠皮膚潰瘍面積比較

腹腔注射STZ 后，模型組和治療組中大鼠進(jìn)食和飲水量明顯增多，體重逐漸減輕，體質(zhì)瘦弱，毛發(fā)呈黃色且無(wú)光澤。如圖1 所示，潰瘍制備第0 天，各組大鼠脊柱兩側(cè)創(chuàng)口規(guī)整，有少量滲出。潰瘍制備第14 天，對(duì)照組潰瘍縮小，可見(jiàn)新鮮肉芽組織，有鼠毛生長(zhǎng)；模型組潰瘍愈合差，潰瘍邊緣可見(jiàn)瘢痕組織，幾乎看不到新鮮肉芽組織，有膿性滲出；治療組潰瘍縮小，潰瘍周邊可見(jiàn)少量肉芽組織及滲出物。不同時(shí)間點(diǎn)各組潰瘍面積比較如表1 所示，與對(duì)照組相比較，模型組和治療組中大鼠皮膚潰瘍面積較大（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組中大鼠皮膚潰瘍面積明顯縮?。≒＜0.05），但仍大于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠皮膚潰瘍愈合情況

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠皮膚潰瘍面積比較

3.2 炎性細(xì)胞因子含量比較

各組炎性細(xì)胞因子含量如圖2 所示，與對(duì)照組相比較，模型組和治療組潰瘍組織炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18 含量均明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組潰瘍組織炎性細(xì)胞因子均顯著減低P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。這些結(jié)果提示，胎盤(pán)粉外敷能夠降低潰瘍組織炎性細(xì)胞因子的含量，減輕潰瘍組織炎癥反應(yīng)。

圖2 各組潰瘍組織炎性細(xì)胞因子含量比較

3.3 細(xì)胞間黏附分子-1 蛋白表達(dá)

各組潰瘍組織中ICAM-1 蛋白表達(dá)如圖3 所示，與對(duì)照組相比較，模型組和治療組ICAM-1 蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組ICAM-1 蛋白水平明顯增高（P＜0.05），但仍低于對(duì)照組（P＜0.05）。這些結(jié)果提示，胎盤(pán)粉外敷能夠促進(jìn)潰瘍組織中ICAM-1 蛋白合成，促進(jìn)潰瘍組織創(chuàng)面愈合。

圖3 各組潰瘍組織中ICAM-1 蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

糖尿病皮膚潰瘍是由于糖代謝紊亂、神經(jīng)病變、血液循環(huán)障礙以及感染等多種因素共同作用誘發(fā)的一種糖尿病并發(fā)癥。在臨床中，糖尿病皮膚潰瘍治療多根據(jù)原因進(jìn)行針對(duì)性地治療,如清創(chuàng)換藥、紅外線短波局部照射治療等，但療效欠佳。在重度潰瘍治療過(guò)程中，因反復(fù)清創(chuàng)、換藥等操作,給患者帶來(lái)極大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種有效的治療方法是目前臨床急需解決的重大問(wèn)題。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，中醫(yī)藥對(duì)糖尿病皮膚潰瘍具有顯著療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，胎盤(pán)提取物具有防止粘連、減輕疼痛和促進(jìn)上皮愈合的作用[8-9]。此外，有研究表明，人胎盤(pán)組織中含有蛋白質(zhì)、糖、鈣、維生素、免疫因子、促性腺激素等多種生物活性物質(zhì)，具有抗感染、抑制尿激酶激活和免疫調(diào)節(jié)功效，能夠有效促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[10-11]。Kwon 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人胎盤(pán)提取物能夠調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖、分化促進(jìn)創(chuàng)口愈合。糖尿病皮膚潰瘍常常繼發(fā)于老年患者，病程長(zhǎng)，創(chuàng)口愈合慢，反復(fù)發(fā)作，且多伴有營(yíng)養(yǎng)不良等原發(fā)性疾病，臨床治療往往依賴(lài)于外科手術(shù)治療，極大地增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中，以糖尿病大鼠為研究對(duì)象制備慢性潰瘍模型，觀察胎盤(pán)粉外敷對(duì)潰瘍愈合的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，采用人胎盤(pán)粉外敷不僅能夠促進(jìn)大鼠糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合，同時(shí)也可降低潰瘍組織中炎癥細(xì)胞因子的含量。IL-1β、IL-6、和IL-18 是白細(xì)胞介素家族成員，能夠促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，并介導(dǎo)炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。TNF-α 來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，具有促炎癥和導(dǎo)致組織炎性損傷的作用[13]。人胎盤(pán)粉中含有多種生物活性物質(zhì)，具有抑制炎癥反應(yīng)，加速創(chuàng)傷愈合的功能。因此，我們推測(cè)，胎盤(pán)粉外敷促進(jìn)潰瘍愈合可能與這些生物活性物質(zhì)的抗炎作用相關(guān)。

ICAM-1 屬于細(xì)胞表面糖蛋白家族成員，具有維持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接以及加強(qiáng)細(xì)胞與基底膜之間黏附的作用，并參與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程。在機(jī)體免疫、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)及分化、炎癥反應(yīng)、毛細(xì)血管形成等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究表明，ICAM-1 通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮特定的生物學(xué)作用，如炎癥時(shí)ICAM-1 表達(dá)升高介導(dǎo)白細(xì)胞的活化，為白細(xì)胞跨越內(nèi)皮游出提供了條件[14]。本研究中，人胎盤(pán)粉外敷能夠促進(jìn)大鼠糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合，我們推測(cè)可能與胎盤(pán)粉促進(jìn)潰瘍局部組織中ICAM-1 表達(dá)有關(guān)，但機(jī)制尚不清楚。

總之，應(yīng)用人胎盤(pán)粉外敷能夠促進(jìn)糖尿病潰瘍瘡面愈合，為糖尿病皮膚潰瘍治療提供了一種有效的方案，但具體治療機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究。