欒同青 張萌萌 王文慶 郝樹彬 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心 （山東 濟(jì)南 250101）

內(nèi)容提要： 根據(jù)中國藥典2015年版四部無菌檢查法，建立適用于藻酸鈣銀離子抑菌敷料的無菌試驗方法，通過方法適用性試驗確定：約1cm×3cm大小的檢驗量在200mL的培養(yǎng)體系中無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可按此方法進(jìn)行無菌檢查。

銀作為抗菌劑使用由來已久，銀離子、可溶性銀化合物、表面積大的膠態(tài)銀、納米銀等均具有殺滅革蘭氏陽性菌（G+）、革蘭氏陰性菌（G-）、真菌及部分病毒的作用[1-3]。藻酸鈣銀離子抑菌敷料可用于處理輕微擦傷、裂傷、割傷、燙傷與燒傷；也可用于壓瘡、手術(shù)后傷口、腿部潰瘍、糖尿病足部潰瘍和部分皮層燒傷等有大量滲液傷口的處理，作為防止微生物滲透的有效屏障，抑制微生物生長，有助于減輕傷口的感染。

藻酸鈣銀離子抑菌敷料與患者創(chuàng)傷組織直接接觸，按《醫(yī)療器械分類規(guī)則》規(guī)定屬第二類或第三類醫(yī)療器械，并且具有廣譜抗菌作用。按照《中國藥典》[4]規(guī)定，“進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查時，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查?！北狙芯恳栽逅徕}銀離子抑菌敷料為對象，擬采用擴(kuò)大培養(yǎng)基用量稀釋抗菌劑濃度的方法，建立適用于該藻酸鈣銀離子抑菌敷料的無菌試驗方法。

1.儀器與材料

1.1 儀器

培養(yǎng)箱(Memmert IPP750plus、BINDER KB400）、厭氧工作站（ELECTROTEK AW200SG）、超凈工作臺（ESCO AVC-6D1）、電子天平（Sartorius BSA822）、生物安全柜（Thermo 1300 SERIES B2）、雙扉滅菌器（Systec DX-200-2D）、壓力蒸汽滅菌器（SANYO MLS-3780）。

1.2 材料

1.2.1 培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號：160602）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：160918），購自于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基即用型平板（批號：17011502）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基即用型平板（批號：16121602），購自于濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司。

1.2.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]（批號：160510）、大 腸 埃 希 菌[CMCC(B)44102]（ 批 號：160705）、 生 孢梭 菌[CMCC(B)64941]（ 批 號：161223）、 白 色 念 珠 菌[CMCC(F)98001]（批號：160830），購自于北京三藥科技開發(fā)公司的定量菌珠。

1.2.3 稀釋液

0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.2.4 培養(yǎng)容器

試管、錐形瓶等。

2.試驗方法

2.1 方法設(shè)計

按照2015年版藥典規(guī)定，根據(jù)該產(chǎn)品性狀，宜選擇直接接種法進(jìn)行該產(chǎn)品的無菌試驗方法設(shè)計，具體參數(shù)設(shè)計如下。

2.1.1 檢驗數(shù)量

試驗組10套；陽性對照組1套。

2.1.2 檢驗量

剪取約1cm×3cm大小。

2.1.3 陽性對照菌株

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌。

2.1.4 陰性對照

取相應(yīng)稀釋液同法操作，作為陰性對照。

2.1.5 供試品處理及接種培養(yǎng)基

以無菌操作的方式剪取供試品約1cm×3cm大小，直接接種培養(yǎng)基。

2.1.6 培養(yǎng)基容器、用量及高度

本研究擬采用增大培養(yǎng)基用量的方式以期消除該產(chǎn)品中銀離子的抑菌作用。通過方法適用性試驗最終確定培養(yǎng)基容器、用量及高度。擬設(shè)計系列培養(yǎng)基用量梯度為40mL（φ30mm×200mm試管，培養(yǎng)基高度9cm）、100mL（250mL錐形瓶，培養(yǎng)基高度4.5cm）、200mL（500mL錐形瓶，培養(yǎng)基高度5.5cm）。

2.2 方法適用性試驗

2.2.1 菌液制備

按照菌珠說明書進(jìn)行操作，將菌珠加至10mL0.9%無菌氯化鈉溶液，制成每1mL含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液。對制備的菌液進(jìn)行活菌計數(shù)以確認(rèn)其濃度符合要求。

2.2.2 方法適用性試驗

2.2.2.1試驗一：40mL培養(yǎng)基

取裝有40mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管。其中1管再接入按照2.1.5處理的供試品，另1管作為對照。置于30～35°C培養(yǎng)不超過5d。

取裝有40mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于l00cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管再接入按照2.1.5處理的供試品，另1管作為對照。置于20～25°C培養(yǎng)不超過5d。

2.2.2.2 試驗二：100mL培養(yǎng)基

取裝有100mL培養(yǎng)基的錐形瓶按照2.2.2.1操作。

2.2.2.3 試驗三：200mL培養(yǎng)基

取裝有200mL培養(yǎng)基的錐形瓶按照2.2.2.1操作。

3.試驗結(jié)果

按照中華人民共和國藥典2015年版四部通則1101無菌檢查法進(jìn)行結(jié)果判斷，試驗結(jié)果見表1～表3。

由表1、表2、表3可知，與相應(yīng)的對照管比較，40mL含供試品各容器中的試驗菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢桿菌均生長良好，白色念珠菌和黑曲霉生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用；100mL含供試品各容器中的試驗菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均生長良好，黑曲霉生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用；200mL含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。

表2.藻酸鈣銀離子抑菌敷料無菌方法適用性試驗結(jié)果(100mL)

表3.藻酸鈣銀離子抑菌敷料無菌方法適用性試驗結(jié)果(200mL)

4.討論

本研究采用直接接種法，通過增大培養(yǎng)基量，擴(kuò)大培養(yǎng)體系，從而消除銀對微生物生長的抑制作用。通過實驗發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品對白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢桿菌，最終確定約1cm×3cm大小的檢驗量在200mL培養(yǎng)體系下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。無菌檢查的供試品接種方法有兩種，直接接種法和薄膜過濾法。醫(yī)療器械不同于藥品，大部分是不溶性的，若采用薄膜過濾法，則涉及到洗脫率問題，故最適宜的接種方法應(yīng)為直接接種法。采用擴(kuò)大培養(yǎng)體系的方法可解決具有抑菌作用醫(yī)療器械的無菌檢查問題。