張暉力，牟妍希，田雨，楊立群，王林

根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌患者占確診的癌癥患者總數(shù)的11.6%，同時肺癌的死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%，肺癌以高發(fā)病率和高死亡率居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者約占所有肺癌患者人數(shù)的80%［1］。迄今為止，手術(shù)仍然是NSCLC最有效的治療選擇，但仍然有一部分NSCLC 患者診斷時已經(jīng)進(jìn)入晚期疾病階段，錯過最佳的手術(shù)時機(jī)，導(dǎo)致預(yù)后不佳。因此，尋找NSCLC發(fā)生發(fā)展中重要的分子靶點可以為NSCLC 的診斷及預(yù)后評估提供新的思路。2000年，Panchin等［2］研究發(fā)現(xiàn)了縫隙連接通道蛋白家族的3 個新成員，包括Panx1、Panx2 和Panx3。近年來的研究表明，Panx1 與多種腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性［3］。然而，Panx1 在NSCLC 方面的研究還鮮有報道。本研究運(yùn)用Real-time PCR、免疫組化等技術(shù)檢測NSCLC組織及癌旁組織中Panx1 的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其在NSCLC方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年11月—2017年12月大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院收治的30例肺癌患者的組織標(biāo)本，病理診斷均為NSCLC，保留癌組織及配對的癌旁組織，其中的25例組織標(biāo)本進(jìn)行了實時熒光定量PCR和免疫組化實驗，另5例組織標(biāo)本只進(jìn)行了免疫組化實驗?；颊咧心?5例，女15例，年齡39～77歲，平均（58.43±10.71）歲。病理分級按照WHO病理分級標(biāo)準(zhǔn)：高分化13例，中分化11例，低分化6例。臨床分期采用國際抗癌聯(lián)盟第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。選取大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院病理科保存的10例正常肺組織蠟塊作為免疫組化實驗的對照組。所有標(biāo)本入組標(biāo)準(zhǔn)：患者病歷資料完整，術(shù)前均無放化療。所有研究對象對本次研究知情并簽署知情同意書。Panx1兔抗人一抗及山羊抗兔IgG 二抗選購自Bioworld 公司，免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB 染色試劑盒購自邁新公司，RNA 提取試劑盒（No.9108）、去除基因組DNA 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（No.RR047A）、SYBR熒光染料（No.RR066A）購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。實時熒光定量PCR 儀購自博日科技公司（型號：FQD-96A），核酸及蛋白分析儀選自Biochrom 公司（型號Biowave DNA），PCR核酸擴(kuò)增儀購自基因有限公司（型號：2720型）。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR （1）引物序列。目的基因Panx1 上游5′- CCTGACAAACCTTGGCATGA-3′，下游5′ -CAGAAGTCTCTGTCGGGCATT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物169 bp；內(nèi)參基因β-actin 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物186 bp。（2）RNA 提取。采用RNA 提取試劑盒提取RNA，提取的總RNA 經(jīng)凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測RNA 純度及濃度，A280/A260≥1.8 為合格，可用于逆轉(zhuǎn)錄；cDNA合成：取1 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；熒光定量PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3 個檢測復(fù)孔。以2-ΔCt值代表樣本中Panx1 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化 將收集到的蠟塊組織按3μm 厚度切片，貼片、烘烤后采用MaxVision 法進(jìn)行免疫組化。切片經(jīng)脫蠟脫水干燥，檸檬酸鹽煮沸行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS沖洗3次，每次2 min，滴加3%H2O2處理10 min 滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次，每次2 min，滴加Panx1兔抗人一抗（1∶100）孵育60 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，滴加山羊抗兔IgG 二抗孵育10 min，之后用PBS 沖洗3 次，每次2 min，DAB 染色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、梯度乙醇脫水透明后封片，于顯微鏡下觀察。

由2位病理科醫(yī)師雙盲閱片。染色強(qiáng)度評分：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%計0 分，5%～25%計1 分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；總分為染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞百分比評分的乘積［4］，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，癌組織及癌旁組織間比較采用配對樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Panx1 mRNA在NSCLC組織及配對癌旁組織中的表達(dá) 25例NSCLC組織中Panx1的相對表達(dá)量為25.31±3.55，與其配對的癌旁組織中Panx1的相對表達(dá)量為12.42±2.29，癌組織中Panx1 mRNA的表達(dá)水平高于與其配對的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.030，P＜0.01）。

2.2 Panx1蛋白在NSCLC 組織、癌旁組織及正常肺組織中的表達(dá) Panx1蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)，陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色分布，見圖1。癌組織、癌旁組織、正常肺組織中Panx1 蛋白的陽性表達(dá)率分別為50%（15/30）、13.3%（4/30）、0，癌組織中的Panx1蛋白的陽性表達(dá)率均高于配對癌旁組織及正常肺組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別為9.320、6.009，均P＜0.017）。

2.3 Panx1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、胸膜侵襲情況、病理分級分組肺癌患者組織中Panx1蛋白的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組的Panx1 蛋白陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Panx1蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Relationship between Panx1 expression and clinicopathological parameters of NSCLC patients表1 Panx1蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系例（%）

3 討論

Panx1 是細(xì)胞膜上的六聚體半通道，細(xì)胞外K+濃度的升高、對細(xì)胞膜的機(jī)械拉伸刺激、膜電壓的變化、S-亞硝基化、一氧化氮（NO）、細(xì)胞外pH的變化、與嘌呤能和腺苷受體的相互作用或caspase3的切割都可以導(dǎo)致Panx1半通道的開放［5］。Panx1半通道的開放在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，細(xì)胞膜上Panx1半通道在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中被激活開放，導(dǎo)致三磷酸腺苷（ATP）由細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而使胞外ATP 濃度升高，而腫瘤微環(huán)境中的高水平ATP作為一種信號，可引起巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的募集，從而促進(jìn)腫瘤抗原呈遞和抗腫瘤免疫［6-7］。同時，胞外ATP 濃度的升高還可進(jìn)一步使Panx1 通道開放，進(jìn)而形成正反饋，擴(kuò)大Panx1 在細(xì)胞凋亡中的作用［8］。

Furlow 等［9］研究證實Panx1 通道的小分子抑制劑可降低乳腺癌轉(zhuǎn)移的效率。Penuela 等［10］研究發(fā)現(xiàn)Panx1 在黑素瘤進(jìn)展過程中上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Wei 等［11］研究發(fā)現(xiàn)用Panx1 siRNA 轉(zhuǎn)染后，U87-MG 惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖減少。Swayne等［12］研究發(fā)現(xiàn)敲除Panx1可以促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分化，從而降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性表型。這些研究證實在某些腫瘤細(xì)胞中Panx1 的表達(dá)上調(diào)，并且可以增加某些腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，選擇性抑制Panx1的表達(dá)和功能可能為某些癌癥的治療帶來新的思路。

Derangere 等［13］研究發(fā)現(xiàn)肝X 受體β 與Panx1 相互作用后，可以特異性誘導(dǎo)caspase-1依賴性結(jié)腸癌細(xì)胞死亡。Xie 等［14］研究發(fā)現(xiàn)Panx1 是潛在的腫瘤抑制因子，在肝癌細(xì)胞組織中以甲基化的形式存在。Wu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Panx1 的表達(dá)可以降低睪丸癌細(xì)胞株I-10/DDP的耐藥性，從而增強(qiáng)順鉑對耐藥型睪丸癌細(xì)胞的毒性作用。Xiang 等［16］證實Panx1通過獨(dú)立于其規(guī)范通道功能的過程在體外和體內(nèi)減輕橫紋肌肉瘤的惡性特性。劉傳亮等［17］研究顯示Panx1在肝癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，并且Panx1的過表達(dá)能夠明顯抑制體內(nèi)外肝癌細(xì)胞增殖能力。這些研究證實Panx1在不同的腫瘤細(xì)胞中的作用存在差異，提示可以針對不同的腫瘤細(xì)胞采用不同的Panx1 干預(yù)，這可能為臨床上不同腫瘤的靶向治療提供新的靶點和依據(jù)。

Fig.1 Immunohistochemical detection of Panx1 expressions in different tissues(×200)圖1 免疫組化檢測不同組織Panx1的表達(dá)（×200）

本研究中，PCR 結(jié)果和免疫組化結(jié)果均顯示NSCLC組織中Panx1的相對表達(dá)水平顯著高于與其配對癌旁組織。這提示Panx1在NSCLC的發(fā)生中起到一定的作用，然而Panx1 在NSCLC 中起促進(jìn)作用或是代償性抑制作用仍待進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果顯示，臨床TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組的Panx1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示Panx1在NSCLC的進(jìn)展中起到重要作用，高水平的Panx1 表達(dá)可能預(yù)示NSCLC進(jìn)展到了晚期階段。此外在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的NSCLC 組織中，Panx1 蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示Panx1 可能參與NSCLC 的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲過程，有助于為臨床上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險評估提供依據(jù)。

綜上所述，Panx1 可能在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲中起重要作用，為臨床上NSCLC的早期診斷及預(yù)后情況評估提供新的思路。然而Panx1 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的具體作用仍未明確，今后將從細(xì)胞層面揭示Panx1在NSCLC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲中的具體作用，進(jìn)而為NSCLC的治療提供新的思路。