孫蓓，葉因濤

肺癌是世界上最常見的原發(fā)性惡性腫瘤［1］。盡管臨床治療技術(shù)不斷發(fā)展，但其治療效果仍不理想。傳統(tǒng)的化療藥物存在毒性大、容易產(chǎn)生耐藥性等不足，因此從天然產(chǎn)物中尋找抗癌藥物已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)?；⒄溶眨╬olydatin，PD）是虎杖根中提取的天然化合物，常被用于治療慢性支氣管炎等疾病［2］。近年來，虎杖苷被發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌等腫瘤具有一定的體外抑制效果［3］，但是其對(duì)肺癌的抑制作用尚鮮見報(bào)道。本研究觀察了虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并初步探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。虎杖苷、青霉素和鏈霉素購自美國Sigma-Aldrich 公司，胎牛血清（FBS）和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Corning 公司，Transwell 細(xì)胞侵襲試劑盒購自美國Coster 公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自美國R&D Systems生物技術(shù)公司，Western blot 相關(guān)抗體購自美國Cell Signaling公司，Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA 合成試劑盒購自大連TaKaRa 公司，ECL 試劑盒購自美國Millipore公司，核因子（NF）-κB報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌A549 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下，在含有10% FBS、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 g/L）的DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞通過0.25%胰蛋白酶-EDTA消化以進(jìn)行傳代。所有實(shí)驗(yàn)均使用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 四氮唑鹽實(shí)驗(yàn)（MTS）檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞（5×104個(gè)細(xì)胞/mL）接種在96孔微量培養(yǎng)板中（每孔100μL），培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的虎杖苷（0、10、20、50、100、200 mg/L）后繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，更換新鮮培養(yǎng)基100μL，加入20μL MTS（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm 波長處光密度（OD）值，表示細(xì)胞生長情況。藥物對(duì)這些細(xì)胞的抑制率計(jì)算如下：抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞（2.5×105個(gè)細(xì)胞/mL）接種在預(yù)鋪有Matrigel 膠的24孔侵襲小室上層（每孔100μL），并加入10 mg/L和20 mg/L虎杖苷處理48 h，小室下層加入500μL完全培養(yǎng)基。4%多聚甲醛室溫固定10 min。經(jīng)HE染色后，通過顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。收集小室上層的培養(yǎng)液用于后續(xù)細(xì)胞因子分泌檢測(cè)。

1.5 ELISA檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549細(xì)胞因子分泌的影響 將侵襲實(shí)驗(yàn)中收集的培養(yǎng)基通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)水平，具體實(shí)驗(yàn)步驟見試劑盒說明書。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TGF-β 和TNF-α含量。

1.6 Western blot 檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549 細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞（3×106個(gè)/mL）接種在6 孔培養(yǎng)板中（每孔100μL），培養(yǎng)過夜，0、10、20 mg/L虎杖苷處理48 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，隨后將其在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后，將膜與抗基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2抗體（1∶1 500）、抗MMP-9 抗體（1∶1 500）、抗整合素（integrin β4）抗體（1∶1 500）、抗Toll 樣受體3（TLR3）抗體（1∶1 500）、抗CD44 抗體（1∶1 500）、抗絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）抗體（1∶1 500）、抗p-AKT 抗體（1∶1 000）在4 ℃條件下孵育過夜，βactin（1∶5 000）作為內(nèi)參。次日洗去表面未結(jié)合的抗體后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗再孵育1 h，用ECL試劑盒顯影，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Real-time PCR 檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549 細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549 細(xì)胞（3×106個(gè)/mL）接種在6 孔培養(yǎng)板中（每孔100μL），培養(yǎng)過夜，用0、10、20 mg/L虎杖苷對(duì)細(xì)胞處理48 h后，使用TRIzol 試劑從組織樣品中提取RNA。使用cDNA合成試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。反應(yīng)程序：95 ℃10 min；94 ℃65 s、60 ℃30 s、72 ℃35 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。PCR 引物序列見表1。

Tab.1 PCR primer sequence表1 PCR引物序列

1.8 報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)虎杖苷對(duì)A549 細(xì)胞NF-κB 啟動(dòng)子活性的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞（3×106個(gè)/mL）接種在6 孔培養(yǎng)板中（每孔100 μL），培養(yǎng)過夜，以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，加入虎杖苷對(duì)細(xì)胞處理48 h，以熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB啟動(dòng)子活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，通過GraphPad 5.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。細(xì)胞增殖抑制率均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)的兩因素方差分析，其他研究均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對(duì)A549 細(xì)胞增殖的抑制作用 MTS 結(jié)果顯示，虎杖苷以劑量依賴（F=403.128，P＜0.05）和時(shí)間依賴（F=709.506，P＜0.05）的方式抑制A549 細(xì)胞體外增殖，兩者具有顯著交互作用(F=44.900，P＜0.05)，IC50（24 h）為172.23 mg/L，IC50（48 h）為75.15 mg/L，IC50（72 h）為34.89 mg/L，見表2。為了觀察虎杖苷對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響和機(jī)制，選取無毒濃度10 mg/L（抑制率＜5%）和低毒濃度20 mg/L（抑制率＜15%）以及抑制率適中的作用時(shí)間（48 h）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免細(xì)胞增殖抑制對(duì)結(jié)果的影響并體現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。

Tab.2 The inhibitory effect of polydatin on proliferation of lung cancer A549 cells表2 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用（n=5，%，）

Tab.2 The inhibitory effect of polydatin on proliferation of lung cancer A549 cells表2 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用（n=5，%，）

a與10 mg/L 組比較，b與20 mg/L 組比較，c與50 mg/L 組比較，d與100 mg/L組比較，P＜0.05

組別10 mg/L組20 mg/L組50 mg/L組100 mg/L組200 mg/L組增殖抑制率24 h 2.3±0.5 4.1±0.5a 9.8±0.9ab 24.5±2.2abc 57.9±5.4abcd 48 h 4.4±0.4 9.8±0.8a 27.3±3.1ab 62.6±7.1abc 99.5±8.5abcd 72 h 10.3±0.9 23.7±1.4a 63.6±5.4ab 97.6±8.9abc 99.6±8.9abc

2.2 虎杖苷對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞侵襲的抑制作用 與0 mg/L 比較，10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷處理48 h 后，A549 細(xì)胞體外侵襲能力顯著下降［侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）：63.3±15.0、41.7±11.5、22.0±5.0，n=3，F(xiàn)=10.047，均P＜0.05］，見圖1。

2.3 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的調(diào)控作用 Western blot 和Real-time PCR 結(jié)果顯示，10 mg/L和20 mg/L虎杖苷處理48 h后，A549細(xì)胞中MMP-2/9、integrin β4、TLR3 和CD44 蛋白和mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見表3、4，圖2。

2.4 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞炎性因子表達(dá)的調(diào)控作用 10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷處理48 h 后，培養(yǎng)基中TGF-β 和TNF-α 含量顯著下調(diào)，TLR3 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見表5、圖3。

Fig.1 The inhibitory effect of polydatin on invasion of lung cancer A549 cells(HE staining,×200)圖1 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲的抑制作用（HE染色，×200）

Tab.3 Polydatin regulated the protein expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells表3 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)的調(diào)控作用（n=5，）

Tab.3 Polydatin regulated the protein expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells表3 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)的調(diào)控作用（n=5，）

＊＊P＜0.01；a 與0 mg/L 組比較，b 與10 mg/L 組比較，P＜0.05；表4～6同

組別MMP-2MMP-9integrin β4CD44 1.000±0.102 0.754±0.082a 0.201±0.018ab 143.940＊＊0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F 1.000±0.095 0.658±0.061a 0.218±0.022ab 174.240＊＊1.000±0.085 0.678±0.057a 0.252±0.021ab 193.485＊＊1.000±0.087 0.576±0.055a 0.182±0.016ab 231.352＊＊

Tab.4 Polydatin regulated the mRNA expression of invasion related genes of lung cancer A549 cells表4 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)控作用（n=5，）

Tab.4 Polydatin regulated the mRNA expression of invasion related genes of lung cancer A549 cells表4 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)控作用（n=5，）

組別0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F MMP-2 1.000±0.055 0.663±0.047a 0.437±0.035ab 186.391＊＊MMP-9 1.000±0.082 0.574±0.042a 0.418±0.030ab 145.030＊＊integrin β4 1.000±0.067 0.417±0.027a 0.288±0.015ab 396.692＊＊CD44 1.000±0.077 0.518±0.044a 0.382±0.031ab 179.232＊＊

Fig.2 Polydatin regulated the expression of invasion related proteins of lung cancer A549 cells圖2 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

Tab.5 The influence of polydatin in the content of inflammatory factor and related gene in lung cancer A549 cells表5 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞炎性因子和相關(guān)基因表達(dá)的影響（n=5，）

Tab.5 The influence of polydatin in the content of inflammatory factor and related gene in lung cancer A549 cells表5 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞炎性因子和相關(guān)基因表達(dá)的影響（n=5，）

組別0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F TGF-β（ng/L）72.31±8.20 57.53±6.49a 36.82±3.85ab 38.391＊＊TNF-α（ng/L）463.43±24.71 341.52±21.17a 261.90±15.37ab 119.326＊＊TLR3 mRNA 1.000±0.078 0.575±0.064a 0.368±0.041ab 131.285＊＊蛋白1.000±0.094 0.821±0.075a 0.376±0.032ab 100.000＊＊

2.5 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞AKT/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用 結(jié)果顯示，10 mg/L 和20 mg/L 虎杖苷處理48 h 后，A549 細(xì)胞中p-AKT 表達(dá)（AKT 磷酸化水平）顯著下調(diào)，見圖4、表6。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，10 mg/L 和20 mg/L 組NF-κB啟動(dòng)子相對(duì)活性顯著下調(diào)，見表6。

Fig.3 Polydatin regulated the protein expression of TLR3 of lung cancer A549 cells圖3 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

Fig.4 Polydatin regulated the phosphorylation of AKT of lung cancer A549 cells圖4 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞AKT磷酸化的調(diào)控作用

Tab.6 The influence of polydatin in the activity of AKT/NF-κB signal pathway in lung cancer A549 cells表6 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞AKT/NF-κB信號(hào)通路的影響（n=5，）

Tab.6 The influence of polydatin in the activity of AKT/NF-κB signal pathway in lung cancer A549 cells表6 虎杖苷對(duì)人肺癌A549細(xì)胞AKT/NF-κB信號(hào)通路的影響（n=5，）

組別0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L F p-AKT相對(duì)表達(dá)量1.000±0.084 0.687±0.051a 0.106±0.011ab 315.741＊＊NF-κB啟動(dòng)子相對(duì)活性1.000±0.080 0.752±0.069a 0.553±0.059ab 51.383＊＊

3 討論

3.1 虎杖苷對(duì)肺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲的抑制作用 肺癌是一種常見的、死亡率高的惡性腫瘤。肺癌患者的不良預(yù)后與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)。在本研究中，筆者觀察到虎杖苷抑制細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞侵襲。這些結(jié)果表明，虎杖苷是具有抗肺癌作用的天然化合物。

3.2 虎杖苷對(duì)肺癌細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用 肺癌轉(zhuǎn)移涉及到多個(gè)基因和信號(hào)通路的改變等，研究虎杖苷干預(yù)肺癌發(fā)生、發(fā)展中關(guān)鍵性的調(diào)控基因是臨床前應(yīng)用基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容?；|(zhì)金屬蛋白酶是重要的促腫瘤侵襲基因，可通過侵蝕細(xì)胞外基質(zhì)造成腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［4］。MMP-2/9是重要的基質(zhì)金屬蛋白酶［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷可抑制A549細(xì)胞MMP-2/9蛋白和mRNA水平。CD44是重要的異質(zhì)性黏附分子，也是重要的促腫瘤侵襲基因［7-8］。本研究也發(fā)現(xiàn)虎杖苷可抑制A549 細(xì)胞CD44 蛋白和mRNA 水平。整合素是由α 和β 亞基組成的多亞基蛋白，其中β1 和β4 亞型與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而其過度表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。整合素β4（integrin β4）可以激活局部黏著斑激酶以進(jìn)一步釋放β-連環(huán)蛋白，后者可以遷移到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)腫瘤生長和侵襲相關(guān)蛋白（如MMP-2/9 和CD44）的表達(dá)［9-11］。在本研究中，虎杖苷可能通過抑制integrin β4表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)MMP-2/9和CD44的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

炎癥因子在肺癌轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用，在肺癌上皮細(xì)胞中激活TLR3，可以通過誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)炎癥因子表達(dá)促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞TGF-β和TNF-α表達(dá)，下調(diào)TLR3表達(dá)，這可能是抑制上述炎癥因子表達(dá)的機(jī)制之一。

3.3 虎杖苷抑制肺癌細(xì)胞體外增殖和侵襲的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 AKT/NF-κB 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和侵襲等多種細(xì)胞過程中起重要作用［12-14］。本研究表明，虎杖苷可以顯著抑制細(xì)胞AKT 磷酸化（p-AKT）和NF-κB啟動(dòng)子活性，這可能是虎杖苷抑制肺癌細(xì)胞的另一個(gè)潛在機(jī)制。

綜上，虎杖苷能夠抑制肺癌A549細(xì)胞的體外增殖和侵襲及遷移，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)和信號(hào)通路，可能是治療肺癌的潛在藥物。本研究中，虎杖苷處理24 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果還不夠顯著，72 h細(xì)胞死亡過多，影響展示真實(shí)結(jié)果，所以只采用具有代表性的48 h 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究。A549 細(xì)胞是肺癌研究中的具有代表性的細(xì)胞系，今后將選取更多的細(xì)胞系進(jìn)行研究。