趙精咪，孫莉，梁浩，程焱

興奮性氨基酸（EAA）是存在于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。其中谷氨酸是最重要的EAA之一，對神經(jīng)元的生長、存活，突觸的連接及適應(yīng)性生長都有著重要作用。約1/3 的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的信息傳遞需要谷氨酸及其受體的參與，這些神經(jīng)元主要分布在大腦皮質(zhì)和海馬，參與學(xué)習(xí)、行為、記憶等多種重要神經(jīng)功能［1］。正常生理環(huán)境下，谷氨酸通過三羧酸循環(huán)、谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)等途徑完成生成、釋放、攝取和失活過程，可避免神經(jīng)元暴露于高濃度谷氨酸而造成神經(jīng)損傷［2］。當(dāng)機體受到代謝、免疫、缺血等方面損傷時，谷氨酸平衡被破壞，大量谷氨酸堆積造成神經(jīng)毒性損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默?。ˋD）［3］、帕金森?。≒D）［4］、肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）［5-6］、多發(fā)性硬化（MS）［7］、亨廷頓病（HD）［8］、精神分裂癥［9］、癲癇［10］、重度抑郁及雙相障礙［11］等都與谷氨酸神經(jīng)毒性損傷因素有關(guān)。MAPK/ERK1/2（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase 1/2）是介導(dǎo)細(xì)胞增殖分化的重要信號通路，在維持細(xì)胞正常形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和增殖方面具有重要作用。然而，在某些損傷條件下，MAPK/ERK1/2 信號通路也可被激活，參與細(xì)胞損傷。已有研究顯示，谷氨酸興奮毒性損傷可引起MAPK/ERK1/2激活，但目前對于MAPK/ERK1/2 抑制劑在谷氨酸神經(jīng)興奮性毒性損傷中的作用尚存在爭議［12-14］，且這些研究結(jié)果多來源于體外研究，鮮有體內(nèi)相關(guān)研究?；诖耍狙芯客ㄟ^開展大鼠體內(nèi)的谷氨酸興奮性毒性研究，以期明確MAPK/ERK1/2 抑制劑對谷氨酸毒性損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量260～280 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。分籠飼養(yǎng)于室溫、自然光環(huán)境下晝夜循環(huán)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。所有動物實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)至少3 d。

1.2 試劑與儀器 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）購自Sigma公司，MAPK/ERK1/2抑制劑U0126購自Merck millipore公司；小鼠抗總ERK1/2 抗體、小鼠抗p-ERK1/2 抗體、小鼠抗Caspase-3（活化形式）抗體、小鼠抗環(huán)氧合酶-2（COX-2）抗體均購自Santa cruz 公司；兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）購自ABclonal 公司；免疫熒光染色一抗及兔抗NeuN 抗體購自Abcam公司；蛋白質(zhì)印跡實驗及免疫熒光染色實驗二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟切片機購自日本Shandon 公司；低溫高速離心機購自美國Kendro 公司；Western blot電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀購自美國Syngene公司。

1.3 谷氨酸神經(jīng)毒性損傷模型建立 大鼠術(shù)前禁食水6 h，10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉。麻醉成功后使大鼠呈俯臥位，將頭部固定于立體定位儀。頭頂皮膚剃毛、消毒，正中位切口，逐層分離肌肉、筋膜，暴露前囟。以前囟為0點，坐標(biāo)為AP+0.5 mm，L 3.5 mm，墨水標(biāo)記，用牙科鉆于標(biāo)記處鉆開顱骨，垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度為1.2 mm，予以藥物注射（1μL）。注射完成后每5 min拔針0.5 mm，直至完全退針?？p合頭皮切口并再次消毒。（1）NMDA 最佳作用濃度篩選。實驗設(shè)正常組（單純手術(shù)處理）、對照組（開顱后注射1μL生理鹽水）和不同濃度（50、100、200 mmol/L）NMDA處理組。（2）最佳作用時間篩選。選取最優(yōu)的NMDA處理濃度，注射后觀察3、6、12、24 h，實驗另設(shè)正常組和對照組。

1.4 分組及處理 根據(jù)已選定的最佳條件，實驗設(shè)對照組，U0126（2 g/L）單獨處理組、NMDA 單獨處理組、不同濃度（0.5、1、2 g/L）的U0126與NMDA聯(lián)合處理組。對照組皮層注射1μL生理鹽水，單純U0126處理組注射1μL的U0126（2 g/L），U0126+NMDA 組于NMDA 注射前30 min 分別注射1 μL 0.5、1、2 g/L的U0126，各組均處理24 h。

1.5 HE 染色 將造模完成后的大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔，從心尖部插入至升主動脈，灌注預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）150 mL，斷頭法處死后剝?nèi)⊥暾X組織于4%多聚甲醛中固定15 h。將腦組織置于大鼠腦模具中，以針刺點為中心，前后各切2 mm，然后取腦組織。將4 mm厚腦組織切片分別經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋，切片。將切片組織脫蠟、脫水后蘇木精染色2 min，伊紅染色1 min，后再次經(jīng)梯度乙醇脫水脫色、二甲苯梯度透明后中性樹膠封片，然后于顯微鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 組織免疫熒光染色 將低溫冰凍切片室溫下復(fù)溫15 min后于冰丙酮中固定10 min，PBS洗滌3遍，0.3%Triton X-100 破膜15 min，PBS 洗滌3 遍，5%BSA 室溫封閉1 h 后滴加NeuN（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶50）一抗混合液于4 ℃過夜。次日PBS 洗滌3 遍后滴加相應(yīng)種屬二抗（1∶120）混合液常溫避光孵育1 h，PBS洗滌3遍后滴加DAPI，封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 取距入針部位前后左右各3 mm的正方形腦皮層組織，組織剪剪碎后每100 mg腦組織加入1 mL 裂解液于冰上超聲勻漿、裂解30 min。4 ℃，13 000 r/min離心15 min 取上清。BCA 法測定蛋白濃度，各組取50μg 蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V，30 min 后120 V，50 min），電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜（100 V，70 min），5%脫脂奶粉封閉1 h，選擇相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜［小鼠抗GAPDH抗體、小鼠抗總ERK1/2抗體、小鼠抗磷酸化-ERK1/2（p-ERK1/2）抗體、小鼠抗Caspase-3（活化形式）抗體、小鼠抗COX-2抗體稀釋比例均為1∶200，兔抗iNOS抗體稀釋比例為1∶1 000］。室溫下將膜與相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗（1∶5 000）孵育1 h，之后進(jìn)行ECL化學(xué)顯影。使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對照組與正常組比較用獨立樣本t檢驗，NMDA不同濃度及不同時間組分別與對照組相比用單因素方差分析；U0126處理中，U0126組與正常組比較用獨立樣本t檢驗，NMDA 組與U0126 不同濃度處理組之間的比較用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NMDA 引起大鼠皮層興奮毒性損傷 50、100、200 mmol/L的NMDA注入大鼠皮層后24 h，其炎癥、凋亡相關(guān)指標(biāo)COX-2、iNOS、Caspase-3（活化形式）均明顯增高（P＜0.05），且具有NMDA 濃度依賴性，選200 mmol/L NMDA 作后續(xù)實驗；同時，200 mmol/L的NMDA 皮層注射3、6、12、24 h 后，COX-2、iNOS、Caspase-3（活化形式）隨時間增加而明顯增高（P＜0.05），見圖1。HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，給予NMDA（200 mmol/L）處理24 h 后，低倍鏡下可見皮層有明顯損傷灶，高倍鏡下可見核固縮，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞排列紊亂，見圖2。

2.2 NMDA 激活MAPK/ERK1/2 信號通路 與NMDA 致皮層興奮毒性損傷的結(jié)果相似，大鼠p-ERK1/2 的表達(dá)水平也隨NMDA 處理濃度和處理時間的延長而升高，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，但總ERK1/2 表達(dá)未見明顯變化，見圖3。同時進(jìn)行p-ERK1/2 與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN 免疫熒光雙染色顯示，與對照組相比，200 mmol/L NMDA 組p-ERK1/2熒光信號明顯增加，且大部分可與NeuN 信號疊加，提示p-ERK1/2主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞中，見圖4。

2.3 U0126保護大腦皮層興奮毒性損傷 與NMDA組相比，U0126單獨處理時COX-2、iNOS、Caspase-3（活化形式）及p-ERK1/2 表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）；同時0.5、1、2 g/L 的U0126 與NMDA（200 mmol/L）聯(lián)合處理的結(jié)果顯示，隨著U0126濃度的增加，COX-2、iNOS、Caspase-3（活化形式）及p-ERK1/2表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），總ERK1/2表達(dá)未見明顯變化（P＞0.05），見圖5、6。HE染色可見U0126單獨處理組與NMDA 組相比，相同解剖層面的損傷面積明顯減小，見圖7。

Fig.1 Effects of NMDA with different time points and different concentrations on the expressions of COX-2,iNOS and Caspase-3(active form)proteins圖1 NMDA不同時間及不同濃度處理對COX-2、iNOS、Caspase-3（活化形式）蛋白表達(dá)的影響

Fig.2 Cortical damage induced by NMDA treatment in rats（HE staining）圖2 NMDA處理引起大鼠皮層損傷（HE染色）

Fig.3 Effects of NMDA with different time points and different concentrations on the expression of p-ERK1/2圖3 NMDA不同時間及不同濃度處理對p-ERK1/2表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of NMDA on p-ERK1/2 expression(Immunofluorescence staining，×400)圖4 NMDA對p-ERK1/2表達(dá)的影響（免疫熒光染色，×400）

3 討論

谷氨酸受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，已知約1/3 的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的信息傳遞需要谷氨酸及其受體的參與，這些神經(jīng)元主要分布在大腦皮質(zhì)和海馬。根據(jù)其作用方式、功能不同可被分為兩大類——代謝型受體和離子通道型受體。代謝型谷氨酸受體屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，可參與調(diào)控細(xì)胞神經(jīng)興奮、突觸的形成以及神經(jīng)變性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。離子型受體是配體介導(dǎo)的通道型受體，包括NMDA受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體和紅藻氨酸（KA）受體，它們可與鈉、鉀、鈣等離子通道偶聯(lián)，形成受體離子通道復(fù)合物，從而介導(dǎo)細(xì)胞間快信號的傳導(dǎo)。已有文獻(xiàn)證明谷氨酸的神經(jīng)毒性主要通過NMDA受體介導(dǎo)［15-17］，有很少部分通過AMPA 及KA 受體，其原理為大量鈣離子內(nèi)流造成鈣超載，觸發(fā)下游通路，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生和線粒體功能障礙，繼而造成神經(jīng)元損傷［18-19］。因此，筆者選用NMDA 大腦皮層微量注射來制作谷氨酸神經(jīng)毒性損傷模型。

Fig.5 The inhibitory effect of U0126 treatment on NMDA-induced expressions of COX-2,Caspase-3(activated form)and iNOS圖5 U0126處理對NMDA誘導(dǎo)的COX-2、Caspase-3（活化形式）、iNOS表達(dá)的抑制作用

Fig.6 The inhibitory effect of U0126 treatment on NMDA-induced the expression of p-ERK1/2圖6 U0126處理對NMDA誘導(dǎo)的p-ERK1/2表達(dá)的抑制作用

Fig.7 The protective effect of U0126 on NMDA damage(HE staining，×10)圖7 U0126處理對NMDA損傷的保護作用（HE染色，×10）

MAPK/ERK1/2 是存在于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，其可使蛋白質(zhì)磷酸化修飾，是多種信號的交匯點。其上游激酶MEK1/2通過引起MAPK/ERK1/2磷酸化而對其具有激活作用。MAPK/ERK1/2激活后，p-ERK1/2可轉(zhuǎn)位入核，對一些核轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。U0126通過特異性抑制MEK1/2，從而在體內(nèi)和體外抑制ERK1/2 的激活［20-21］。本研究中，NMDA 處理3 h 即可引起p-ERK1/2 表達(dá)增加，該作用一直持續(xù)至24 h，由此提示，NMDA處理可引起大腦皮層ERK1/2大量激活。

已有文獻(xiàn)證明ERK1/2 激活參與了谷氨酸興奮毒性損傷的多種信號途徑。例如，ERK1/2激活可介導(dǎo)炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)［22］；ERK1/2激活可引起NADPH 氧化酶關(guān)鍵催化亞基gp91phox 的表達(dá)增加［23］；另外，ERK1/2 激活還可介導(dǎo)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的NF-κB 的表達(dá)增加［24］。筆者也觀察到NMDA 在引起腦組織損傷的同時，濃度依賴性地誘導(dǎo)炎性、凋亡相關(guān)因子COX-2、iNOS 及活化的Caspase-3 表達(dá)。同時，給予ERK1/2 抑制劑U0126后，隨著U0126 濃度的增加，NMDA 引起的ERK1/2活化被顯著抑制，且大腦皮層損傷面積減小，COX-2、iNOS 及活化的Caspase-3 表達(dá)明顯降低。由此，筆者推測U0126通過阻斷MAPK/ERK1/2途徑，抑制細(xì)胞的炎性反應(yīng)及凋亡，減少大腦皮層興奮毒性損傷。另外，與單純抗炎、抗氧化或抑制細(xì)胞凋亡相比，由于ERK1/2激活參與介導(dǎo)了NMDA引起的多種損傷途徑，ERK1/2抑制劑對這些途徑能夠同時具有抑制作用，因此可能具有更好的保護效果。

盡管ERK1/2的早期激活介導(dǎo)了一系列炎癥、凋亡反應(yīng)，但同時它的激活也參與了晚期組織細(xì)胞的修復(fù)再生。有文獻(xiàn)證實ERK1/2通過促進(jìn)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖參與了損傷后上皮細(xì)胞的修復(fù)和損傷后纖維化，同時ERK1/2參與了Egr-1基因?qū)ιL因子表達(dá)的調(diào)控，從而參與新生血管的形成［25-27］。因此，推測ERK1/2抑制劑（U0126等）需要在谷氨酸興奮毒性損傷早期給予，這樣既可抑制ERK1/2的激活及其介導(dǎo)的損傷反應(yīng)，也可避免干擾晚期ERK1/2激活介導(dǎo)的腦組織自我修復(fù)及再生。U0126 及PD98059 等為第一代ERK1/2 抑制劑，新型ERK1/2抑制劑，如SCH772984 和已經(jīng)應(yīng)用于臨床的維羅非尼（Vemurafenib）等目前只是應(yīng)用于部分腫瘤患者的治療及研究［28-29］，期待更多開展新型ERK1/2抑制劑對谷氨酸興奮毒性損傷的相關(guān)研究。

綜上所述，ERK1/2抑制劑U0126對于谷氨酸引起的神經(jīng)毒性損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與抑制ERK1/2激活及其下游的炎癥、凋亡信號途徑有關(guān)。