欒慶祥，黃鑫，楊強(qiáng)，金曉峰，錢(qián)莘莘

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng) 550003)

龍膽瀉肝散是由龍膽、梔子、黃芩、柴胡等10味中藥制成的散劑，功能瀉肝膽實(shí)火，清三焦?jié)駸幔?主治目赤腫痛，淋濁，帶下，收錄在2015年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》二部[1]。其藥用歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛，但因各生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)條件和工藝不盡相同，質(zhì)量參差不齊，臨床療效也有所差異，因此，控制龍膽瀉肝散的質(zhì)量才能保證其臨床的藥用療效。實(shí)驗(yàn)擬建立中藥龍膽瀉肝散中活性成分龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量測(cè)定方法，以控制龍膽瀉肝散的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等(美國(guó)Agilent公司)；Waters 2695高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等(美國(guó)Waters公司)；ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，XDB-C18(4.6 mm×250 mm , 5 μm)色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；XS105型和ME802E型電子天平(瑞士METTLER公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑 龍膽苦苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110770-201013)；黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110715-201117)；梔子苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110749-200613)；龍膽瀉肝散(遵義縣獸藥廠，批號(hào)：120901，120902，120903，140101，140102，140103，140201，140202，140203，140204)；甲醇為色譜純；磷酸為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇(C)∶0.2%磷酸溶液(A)梯度洗脫，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫為30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑, 配制混合對(duì)照品溶液, 其中含龍膽苦苷80.09 μg/mL、梔子苷50.30 μg/mL、黃芩苷99.53 μg/mL，即得。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions

2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按2015年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》二部中龍膽瀉肝散項(xiàng)下處方的配比，除去龍膽、黃芩和梔子，然后制得陰性對(duì)照樣品，取約0.67 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性和專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μL注入高效液相色譜儀。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，龍膽苦苷峰和梔子苷峰分離度大于2.0，黃芩苷峰與相鄰組分峰分離度均大于2.0，理論板數(shù)以龍膽苦苷峰計(jì)不低于5000，陰性對(duì)照在與對(duì)照品和供試品色譜峰相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰；結(jié)果表明處方中的其他成分對(duì)龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的定量測(cè)定無(wú)干擾，專(zhuān)屬性能滿足檢測(cè)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，于制備后0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜峰面積，龍膽苦苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.31%，梔子苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.04%，黃芩苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.67%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖(A、B、C分別為對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test(A: reference substances, B:Test samples, C: negative samples)

2.7 線性關(guān)系考察 取2.2項(xiàng)下制得的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 5、10、15、20、25、40 μL，測(cè)定各組分峰面積。以各組分質(zhì)量濃度(C) 為橫坐標(biāo),相應(yīng)峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。龍膽苦苷回歸方程A=11.87C+1.40，r=0.9998,龍膽苦苷在0.400～3.203 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；梔子苷回歸方程A=8.55C+25.56，r=0.9999,梔子苷在0.252～2.012 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃芩苷回歸方程 A=14.08C+6.53，r=0.9999,黃芩苷在0.500～3.981 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 采用加標(biāo)回收的方法，在已知含量的龍膽瀉肝散供試品中加入一定質(zhì)量的龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對(duì)照品，使其制備后在供試品中的量為其含量的100%，平行制備6份。再按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算出實(shí)際加入的標(biāo)對(duì)照品的含量，用實(shí)際計(jì)算出來(lái)的加入量比上由稱量得到的加入量，即得。取已測(cè)定梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的龍膽瀉肝散樣品(批號(hào)：120902)6份，每份1 g，精密稱定，每份分別精密加入2.003 mg/mL龍膽苦苷對(duì)照品溶液、3.850 mg/mL梔子苷對(duì)照品溶液和7.100 mg/mL黃芩苷對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機(jī)測(cè)定。龍膽苦苷回收率為90.5%～92.4%，平均回收率為91.5%，RSD為0.77%；梔子苷回收率為88.1%～92.4%，平均回收率為90.2%，RSD為1.58%；黃芩苷回收率為92.8%～96.7%，平均回收率為94.6%，RSD為1.74%；結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)Tab 2 Recovery results of gentiopicroside, geniposide and baicalin

2.9 精密度試驗(yàn) 取龍膽瀉肝散供試品(批號(hào)：120902)溶液，精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的峰面積，計(jì)算得出龍膽苦苷峰面積的RSD為0.78%，梔子苷峰面積的RSD為0.79%，黃芩苷峰面積的RSD為0.70%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)Tab 3 Precision test

續(xù)表

2.10 耐用性試驗(yàn) 取2.8準(zhǔn)確度測(cè)定項(xiàng)下制得的樣品，按既定流動(dòng)相梯度洗脫條件和流速不變，在Waters2695和Agilent 1260高效液相色譜儀上分別使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱和Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，于20℃、30℃、40℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀、色譜柱、柱溫等因素的小范圍變化，測(cè)定龍膽瀉肝散中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量無(wú)顯著差異，說(shuō)明耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的龍膽瀉肝散，分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL上機(jī)測(cè)定峰面積，根據(jù)上述擬合的曲線方程外標(biāo)法定量，計(jì)算出供試樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 供試樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Conten determination results of gentiopicroside, geniposide and baicalin

3 討論與結(jié)論

3.1 含量測(cè)定成分的選擇 龍膽瀉肝散是由龍膽、梔子、黃芩等10味中藥制成的散劑，其中龍膽為君藥，梔子和黃芩為臣藥[2]?！吨袊?guó)獸藥典》2015年版中龍膽、梔子和黃芩質(zhì)量控制的目標(biāo)成分分別是龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷；龍膽苦苷是龍膽的主要活性成分之一，具有保肝、利膽、抗炎、抗過(guò)敏、健胃等多種藥理作用[3-5]；梔子苷具有降血壓、改善胃功能、保護(hù)肝臟、促進(jìn)膽汁分泌、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等作用，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)方面有重要作用[6]；黃芩苷具有強(qiáng)效的清除氧自由基、抗過(guò)敏反應(yīng)、抑制炎性分子、病毒和細(xì)菌、解痙、利尿作用[7]；且在《中國(guó)獸藥典》2015年版中龍膽瀉肝散質(zhì)量控制的目標(biāo)成分是龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷，所以龍膽瀉肝散含量測(cè)定的成分選擇龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷。

3.2 樣品前處理方法的選擇 龍膽苦苷和梔子苷為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物，易溶于水和甲醇，提取方法一般采用回流法[8-9]，黃芩苷為黃酮類(lèi)化合物，易溶于甲醇，提取方法一般采用回流法和超聲法[10]，參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部龍膽瀉肝散含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，采用50%甲醇超聲提取20 min，結(jié)果表明該方法能夠較完全的提取出龍膽瀉肝散中的龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的對(duì)照品溶液，經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，龍膽苦苷在271 nm 處有最大吸收，黃芩苷在278 nm 處有最大吸收，梔子苷在237 nm 處有最大吸收，本試驗(yàn)選取254 nm同時(shí)測(cè)定這3個(gè)組分，結(jié)果在選定的條件下3組分均有較高的紫外吸收值，且各組分分離度良好，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

采用高效液相色譜法測(cè)定龍膽瀉肝散中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，該方法簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可有效控制該制劑的中主藥龍膽、梔子和黃芩的質(zhì)量，通過(guò)對(duì)三個(gè)批次的10個(gè)實(shí)際樣品的測(cè)定，龍膽苦苷含量為2.01～3.57 mg，梔子苷含量為3.39～3.98 mg，黃芩苷含量為6.71～7.98 mg，均滿足《中國(guó)獸藥典》2015年版二部中龍膽瀉肝散項(xiàng)下對(duì)龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷含量的要求，說(shuō)明制劑生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量穩(wěn)定。