潘建剛，陳波，周明光，徐高原

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病的主要病原[1]，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國(guó)地方豬種和雜交豬種尤為易感，幾乎普遍存在，造成了重大損失。豬群一旦感染Mhp，便難以清除[2]，可繼發(fā)感染PRRSV、PCV2 等[3-4]，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗。由于豬肺炎支原體對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，使得其體外分離培養(yǎng)難度很大[5-6]；同時(shí)在分離過(guò)程中還易受豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)的影響[7]，給本病的研究工作帶來(lái)了困難。本試驗(yàn)從全國(guó)部分豬場(chǎng)采集到的疑似豬支原體肺炎病變肺臟中成功分離獲得1株豬肺炎支原體，以期為豬支原體肺炎疫苗的研究提供必要條件和有利數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 疑似豬支原體肺炎的發(fā)病豬肺臟采集自全國(guó)部分豬場(chǎng)，肺臟的尖葉、心葉、中間葉或膈葉前緣有不同程度的對(duì)稱性病變，呈“肉樣變”、“胰樣變”，共12 份。

1.1.2 豬肺炎支原體培養(yǎng)基 由武漢科前生物股份有限公司制備。

1.1.3 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 3周齡仔豬，購(gòu)自華農(nóng)試驗(yàn)種豬場(chǎng)，母豬未注射豬支原體肺炎疫苗，經(jīng)IDEXX試劑盒檢測(cè)仔豬血清中豬肺炎支原體(Mhp)、豬圓環(huán)病毒( PCV2)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒( PRRSV) 抗體陰性。

1.1.5 豬肺炎支原體陽(yáng)性血清 本實(shí)驗(yàn)室從北京生泰爾生物科技有限公司購(gòu)進(jìn)的豬肺炎支原體J株制備兔抗豬肺炎支原體特異性血清，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32，批號(hào)為170502。

1.1.6 豬鼻支原體陽(yáng)性血清 從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心購(gòu)進(jìn)的豬鼻支原體BTS-7株制備兔抗豬鼻支原體特異性血清，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶16，批號(hào)為170301。

1.1.7 攻毒用強(qiáng)毒株 豬肺炎支原體(濟(jì)南系強(qiáng)毒CVCC354株)，F(xiàn)3代，由武漢科前股份有限公司復(fù)壯、保管和供應(yīng)。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 將采集的12份病料分別用含800 U/mL青霉素的PBS洗去血液和組織碎片，無(wú)菌操作剪取有豬喘氣病特征病變和將健康交界處的肺組織進(jìn)行PCR鑒定和供分離培養(yǎng)。

1.2.2 病料PCR鑒定

1.2.2.1 病料DNA提取 取約0.5 g病料，剪碎后勻漿器加2.0 mL水研磨成糊狀，先3000 r/min離心5 min，上清再以13000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用250 μL PBS重懸。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取重懸液DNA，-20 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR鑒定 PCR引物按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[8]。豬肺炎支原體引物序列：P1：5'- TTACAGCGGGAAGACC-3'；P2：5'-CGGCGAGAAACTGGATA-3'；PCR擴(kuò)增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物P1(10 μM)1.0 μL，引物P2(10 μmol/L)1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為427 bp。

1.2.2.3 多重PCR鑒定 多重PCR引物按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行合成[9-10]，引物序列：Mhp-f：5'-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3'；Mhr-f：5'-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3'；M-r：5'-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3'；多重?cái)U(kuò)增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，上游引物均為(10 μmol/L)0.8 μL，下游引物為(10 μmol/L)1.2 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火50 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。預(yù)計(jì)豬肺炎支原體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1000 bp；豬鼻支原體擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1129 bp。

1.2.3 病原的分離 將病料研磨后過(guò)濾，接入含10%豬鼻支原體特異性血清、800 U/mL青霉素的豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)。每間隔7日盲傳1次，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化，前3代均加入10%豬鼻支原體特異性血清。在培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，傳代可出現(xiàn)pH規(guī)律性下降的培養(yǎng)菌液進(jìn)行鑒定，剩余培養(yǎng)菌液于-20 ℃以下凍存。

1.2.4 病原的PCR鑒定及測(cè)序 將經(jīng)培養(yǎng)傳代分離的菌株提取基因組DNA，按1.2.2.2方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳?；厥债a(chǎn)物送往擎科公司測(cè)序。

1.2.5 形態(tài)觀察 按常規(guī)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行瑞氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.6 生化特性 將臨床分離株進(jìn)行尿素酶活性測(cè)定；葡萄糖分解試驗(yàn)；精氨酸水解試驗(yàn)；三苯基氯化四氮唑( TTC)試驗(yàn)；七葉苷水解試驗(yàn)；甘露醇分解試驗(yàn)；膜和斑形成試驗(yàn)。生化實(shí)驗(yàn)按參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。

1.2.7 血清學(xué)特性 生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：將直徑為6 mm的圓形濾紙片用未經(jīng)稀釋的抗血清浸泡后放入無(wú)菌平板內(nèi)，4 ℃干燥待用。吸取待檢菌株的菌液0.1 mL涂布于固體平皿中，放置37 ℃使瓊脂表面稍干燥，無(wú)菌夾取抗血清濾紙片貼于瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)10日。在低倍顯微鏡下觀察，當(dāng)濾紙片周圍無(wú)菌落生長(zhǎng)，出現(xiàn)抑制帶大于1.0 mm時(shí)，判為豬肺炎支原體陽(yáng)性。

1.2.8 致病性分析 將分離菌株菌液分別經(jīng)氣管注射3周齡仔豬4頭，5 mL/頭(109CCU)。另設(shè)4 頭條件相同的對(duì)照豬，各氣管注射培養(yǎng)基5 mL，作為對(duì)照。試驗(yàn)豬、對(duì)照豬隔離飼養(yǎng)。每天觀察發(fā)病情況，并于注射后28 d全部剖殺，觀察肺部病變，根據(jù)Goodwin氏55分評(píng)分法對(duì)試驗(yàn)仔豬的肺臟病變進(jìn)行打分[12]。取部分病變組織置于10%的甲醛溶液固定，隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE 染色等一系列病理切片制作流程后，在顯微鏡下讀片，觀察組織病理變化，了解菌株對(duì)仔豬的毒力，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.9 免疫原性試驗(yàn) 將分離株菌株濃縮純化、滅活后與佐劑混合制備滅活疫苗，將疫苗分別頸部肌肉注射3周齡仔豬4頭，2.0 mL/頭(109CCU)，接種后21 d，按相同途徑、相同劑量二免。另外4頭不接種作為對(duì)照，同條件下飼養(yǎng)。二免14 d，連同對(duì)照豬4頭，各氣管注射豬肺炎支原體(濟(jì)南系強(qiáng)毒CVCC354株)凍干肺組織毒5 mL(含0.5 g病肺組織)，每日觀察仔豬臨床癥狀，攻毒后28 d，撲殺全部仔豬。按55分法對(duì)各仔豬的肺部喘氣病病變進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算肺炎病變減少率。

2 結(jié) 果

2.1 病料PCR鑒定 12份病料，其中4份病料檢測(cè)出有豬肺炎支原體(圖1)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陽(yáng)性對(duì)照;2: 陰性對(duì)照; 3-14: 病料樣品M: DL2000 DNA Marker; 1: Positive control;2: Negative control; 3-14: Tissue samples圖1 肺組織PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 1 PCR results for the lung tissues

2.2 病料多重PCR鑒定 4份陽(yáng)性病料經(jīng)過(guò)多重PCR檢測(cè)都能擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1000 bp豬肺炎支原體目的片段，但其中有3份陽(yáng)性病料還擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1129 bp豬鼻支原體目的片段(圖2)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陰性對(duì)照;2: 豬鼻支原體陽(yáng)性對(duì)照; 3: 豬肺炎支原體陽(yáng)性對(duì)照; 4: 豬鼻支原體陽(yáng)性對(duì)照、豬肺炎支原體陽(yáng)性對(duì)照; 5-8: 病料樣品M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2: Positive control(Mhr); 3: Positive control (Mhp); 4: Positive control (Mhr、Mhp); 5-8: Tissue samples圖2 陽(yáng)性病料多重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Multiple PCR results for the positive samples

2.3 病原分離 取只含有豬肺炎支原體的1份病料，研磨后進(jìn)行分離、培養(yǎng)傳代，傳至第3代時(shí)，培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，接著傳至第8代，菌種能在培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)，pH規(guī)律性下降，生長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定在3～4 d，活菌滴度可達(dá)109CCU/mL。

2.4 病原PCR鑒定 菌株擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段427 bp大小一致(圖3)。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI BLAST比對(duì)，分離株P(guān)36基因序列與豬肺炎支原體J株和168株同源性分別達(dá)99%以上，從分子水平上證明了分離的菌株為豬肺炎支原體。

M: DL2000 DNA Marker; 1: 陽(yáng)性對(duì)照; 2: 陰性對(duì)照; 3: 分離菌株M: DL2000 DNA Marker; 1: Positive control; 2: Negative control; 3: Isolated strain圖3 菌液PCR檢測(cè)結(jié)果Fig 3 PCR results for the bacterial fluid

2.5 形態(tài)學(xué)特性 分離豬肺炎支原體菌株經(jīng)過(guò)瑞士染色，鏡檢，觀察到特征性的多形態(tài)，有點(diǎn)狀、環(huán)狀、球狀和兩極狀(圖4)。

圖4 瑞士染色結(jié)果(100×)Fig 4 The results of wright's stain(100×)

2.6 生化特性 分離菌株生化反應(yīng)與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)Tab 1 The biochemical tests of isolated strain

“ +” 陽(yáng)性; “ -” 陰性

“ +” Positive; “ -” Negative

2.7 生長(zhǎng)抑制 吸有抗血清的濾紙片周圍出現(xiàn)了直徑為2.6 mm的抑菌圈，驗(yàn)證分離的菌株為豬肺炎支原體。

2.8 致病性 攻毒組豬氣管內(nèi)注射5 mL分離株菌液后，大部分豬出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀，對(duì)照組無(wú)癥狀(表2)；剖檢攻毒豬，發(fā)現(xiàn)肺臟的尖葉、心葉前端有部分對(duì)稱性的肉樣變化(02號(hào)和04號(hào)攻毒豬肺臟如圖5所示)；攻毒組豬肺臟病變組織制片經(jīng)過(guò)HE染色后，在顯微鏡下觀察，肺間質(zhì)增寬、增厚，肺泡內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(02號(hào)和04號(hào)攻毒豬肺臟病變組織切片如圖6所示)，以上說(shuō)明分離的豬肺炎支原體具有一定的致病性。

2.9 免疫原性 免疫組豬臨床觀察基本正常，對(duì)照組豬有支原體肺炎典型咳嗽、喘氣的臨床癥狀，根據(jù)肺炎病變打分，免疫組平均肺炎病變減少74.51%(表3)；剖檢試驗(yàn)豬，免疫組和對(duì)照組肺部有明顯差異，免疫組豬肺組織病變不明顯，對(duì)照組病變嚴(yán)重，肺臟的尖葉、心葉前緣有嚴(yán)重的對(duì)稱性病變，呈“肉樣變”、“胰樣變”(12號(hào)免疫組豬，18號(hào)對(duì)照組豬肺臟如圖7)，以上說(shuō)明分離的豬肺炎支原體具有很好的免疫原性。

表2 臨床癥狀和肺病變得分結(jié)果Tab 2 The clinical manifestation and score of pathologe variation of piglets lung

圖5 肺臟臨床解剖圖Fig 5 Clinical anatomy of lung

圖6 肺臟病理切片觀察(HE 40×)Fig 6 Observed of pathophysiology of lung(HE 40×)

組別耳號(hào) 臨床癥狀肺炎病變得分肺部病變平均得分平均肺部病變減少率免疫組11攻毒后22天出現(xiàn)輕微咳嗽612無(wú)咳嗽、喘氣等癥狀313無(wú)咳嗽、喘氣等癥狀014無(wú)咳嗽、喘氣等癥狀43.2574.51%對(duì)照組15攻毒后20天出現(xiàn)輕微咳嗽1016攻毒后21天出現(xiàn)輕微咳嗽717攻毒后16天出現(xiàn)咳嗽、喘氣1618攻毒后15天出現(xiàn)咳嗽、喘氣1812.75-

圖7 肺臟臨床解剖圖Fig 7 Clinical anatomy of lung

3 討論與結(jié)論

豬肺炎支原體感染豬時(shí)，常伴有豬鼻支原體混合感染，從豬體內(nèi)進(jìn)行豬肺炎支原體的分離非常困難?，F(xiàn)有疫苗菌株分離年代都比較久遠(yuǎn)，保護(hù)效果有一定的降低。本研究通過(guò)采集疑似豬支原體感染的組織病料，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，多重PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性病料接到豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，成功分離到一株菌株。分離的菌株經(jīng)測(cè)序、形態(tài)觀察、生化特性、血清學(xué)特性鑒定為豬肺炎支原體，此株豬肺炎支原體與常用的疫苗菌株同源性好，并且是從最近發(fā)病的豬場(chǎng)分離而來(lái)，為潛在的疫苗菌株。

在致病性試驗(yàn)中，分離菌株菌液進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)分離菌株經(jīng)過(guò)傳代仍具有一定的毒力，可致仔豬產(chǎn)生咳嗽等支原體肺炎典型的臨床癥狀，剖檢能觀察到肺部肉變，病理切片顯示感染豬均表現(xiàn)不同程度的間質(zhì)性肺炎；在免疫原性試驗(yàn)中，分離株制備滅活疫苗免疫仔豬后攻毒，免疫組肺炎病變平均減少74.51%，分離菌株免疫原性良好。對(duì)仔豬的致病性試驗(yàn)和免疫原性試驗(yàn)可以證明，分離株適合作為滅活疫苗的制苗用菌株。