程 鑫，張 珩，馬濟(jì)美

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖北 武漢 430070)

β-葡萄糖苷酶是纖維素分解酶系中的重要組成成分，能夠水解結(jié)合于多糖或糖綴合物末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-葡萄糖苷酶可以參與纖維素的代謝以及多種生理生化過程，并廣泛存在于各種動植物和真菌體內(nèi)[1-3]。因此，對β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用在多個領(lǐng)域中被廣泛開展，例如，在食品工業(yè)領(lǐng)域，β-葡萄糖苷酶被用來使蔬菜、水果、茶葉等食物產(chǎn)生增香作用[4]；在臨床醫(yī)學(xué)中，β-葡萄糖苷酶在疾病(如高氏病等)的診斷、治療中發(fā)揮著重要作用[5-6]；日用化工業(yè)中利用β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用生產(chǎn)非離子表面活性劑烷基糖苷；β-葡萄糖苷酶在微生物、土壤、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域也起著至關(guān)重要的作用[7-8]。

目前，β-葡萄糖苷酶的檢測方法主要有分光光度比色法和熒光光譜法。比色法常以水楊苷或?qū)ο趸交?β-葡萄糖苷(pNPG)為底物，操作簡便，但易受干擾。熒光法多使用4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)為底物[9]，通過測定酶解產(chǎn)生的4-甲基傘形酮的吸光度測定β-葡萄糖苷酶的活性[10];此法靈敏度較高，但體系pH值對4-甲基傘形酮的熒光有很大影響，而且其藍(lán)色熒光易與生物樣品的背景重疊，受其他酶干擾，故應(yīng)用范圍受到限制。因此，有必要開發(fā)簡便高效的檢測β-葡萄糖苷酶的方法。

刃天青(Resazurin)是一種藍(lán)色染料，被廣泛用作生物指示劑[11]。刃天青還原法廣泛應(yīng)用于食品和生物檢測，包括食品中微生物含量的生化測試[12-13]，血糖的測定[14]，葡萄糖氧化酶[15]、堿性磷酸酶[16]和酪氨酸磷酸酶的檢測，精液樣品中代謝活性精子的濃度估算[17-18]，微生物生物膜活性的染色定量檢測[19]，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的活性測定[20]，十字花科植物種子的活性檢測等[21-22]。

利用刃天青被還原后熒光增強(qiáng)的性質(zhì)，本文開發(fā)了一種簡單靈敏的熒光方法用于β-葡萄糖苷酶活性的檢測。該法以2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2βG)為底物，通過酶解生成抗壞血酸(Ascorbic acid,AA)，將刃天青還原生成具有強(qiáng)烈熒光的試鹵靈(Resorufin)，通過體系熒光強(qiáng)度變化檢測β-葡萄糖苷酶的活性。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

帶有氙燈的Shimadzu RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)；Agilent 1200高效液相色譜(美國安捷倫科技有限公司)；600 MHz Brucker核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)。超純水通過Millipore Milli-Q Academic儀器(德國默克密思博有限公司)純化得到。

刃天青(樹脂天青，純度90%)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸、抗壞血酸均購于阿拉丁試劑有限公司，β-葡萄糖苷酶(10 U)購自上海寶曼生物公司(中國)。2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2βG)由本課題組根據(jù)文獻(xiàn)[23]合成。其余試劑均購于國藥集團(tuán)或阿拉丁試劑有限公司，直接使用，溶劑在使用前均經(jīng)干燥和純化。

1.2 實(shí)驗內(nèi)容

1.2.1抗壞血酸還原刃天青實(shí)驗用pH 7.5的20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液配制20 μmol/L的刃天青溶液和2.5 mmol/L的抗壞血酸溶液。取0.5 mL 20 μmol/L的刃天青溶液加入到1 mL 2.5 mmol/L的抗壞血酸溶液中，于37 ℃下反應(yīng)，檢測反應(yīng)液在0、10、20、30、40、50、60 min時的紫外吸收光譜。

1.2.2抗壞血酸的檢測取200 μL 20 μmol/L的刃天青溶液和1 mL不同濃度的抗壞血酸在55 ℃下反應(yīng)120 min，檢測反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。

圖1 酶誘導(dǎo)還原刃天青機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of enzymatic induced reduction of resazurin

1.2.3β-葡萄糖苷酶的檢測用pH 5.0的10 mmol/L檸檬酸和磷酸氫二鈉緩沖液配制10 mmol/L的AA-2βG溶液和不同濃度的β-葡萄糖苷酶溶液，取100 μL AA-2βG溶液和200 μL不同濃度的β-葡萄糖苷酶溶液在45 ℃下反應(yīng)45 min后，加入30 μL 100 mmol/L的NaOH溶液調(diào)至pH 7.5，再加入用100 μL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制的20 μmol/L的刃天青溶液，55 ℃下反應(yīng)1 h，檢測反應(yīng)溶液的熒光變化。

圖2 不同條件下傳感系統(tǒng)的熒光響應(yīng)Fig.2 Fluorescence response of the sensing system at different conditionsa.20 mmol/L resazurin;b.a+500 U/L β-glucosidase; c.a+15 mmol/L AA-2βG;d.b+15 mmol/L AA-2βG; excitation wavelength:530 nm

圖3 刃天青和抗壞血酸混合后的紫外光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of resazurin incubating with ascorbic acid2.5 mmol/L ascorbic acid was mixed with 20 mmol/L resazurin in 20 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5),and the spectra were recorded each 10 min;inserts:photographs of the corresponding reaction mixtures in the process of the reaction under normal visible light

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測機(jī)理

設(shè)計方法的檢測機(jī)理如圖 1所示，首先以合成的AA-2βG為底物，非還原性的AA-2βG在β-葡萄糖苷酶的水解作用下生成抗壞血酸。刃天青作為一種很好的氧化還原指示劑，可以響應(yīng)體系中所產(chǎn)生的抗壞血酸，被抗壞血酸還原生成試鹵靈，從而釋放出強(qiáng)烈熒光。刃天青自身幾乎沒有熒光，底物AA-2βG和β-葡萄糖苷酶對其熒光強(qiáng)度基本沒有影響(圖2曲線a、b、c)，當(dāng)刃天青與AA-2βG和β-葡萄糖苷酶混合后，體系產(chǎn)生的抗壞血酸將刃天青還原成試鹵靈，在585 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光(圖2曲線d)，因此可以通過檢測溶液的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的分析檢測。

2.2 抗壞血酸還原刃天青實(shí)驗

將刃天青和抗壞血酸混合，隨著時間的延長，混合液在波長380 nm和600 nm處的紫外吸收強(qiáng)度逐漸降低，同時在571 nm處出現(xiàn)新的紫外吸收峰且強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖3)。在此過程中，混合溶液的顏色從最開始的青藍(lán)色變?yōu)樽霞t，最終變?yōu)榉奂t色。

2.3 抗壞血酸檢測條件的優(yōu)化

本實(shí)驗中，β-葡萄糖苷酶檢測的靈敏性直接取決于抗壞血酸檢測的靈敏度。因此考察了緩沖液pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對抗壞血酸和刃天青體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，pH 7.5時體系熒光強(qiáng)度最大，在此條件下，當(dāng)體系溫度為55 ℃，反應(yīng)時間為1 h時，抗壞血酸的檢測效果最好。

在上述優(yōu)化條件下，將20 μmol/L的刃天青溶液和不同濃度的抗壞血酸溶液反應(yīng)，結(jié)果顯示，抗壞血酸溶液的濃度在3～400 μmol/L范圍內(nèi)與反應(yīng)體系在585 nm處的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.981。

2.4 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

利用β-葡萄糖苷酶的水解活性，以AA-2βG為底物，測定其酶學(xué)特性。用pH 5.0的檸檬酸和磷酸氫二鈉為反應(yīng)緩沖液，配制500 U/L的β-葡萄糖苷酶溶液、300 mmol/L的AA-2βG溶液，分別于20、30、40、45、50、55、60 ℃下反應(yīng)1 h。結(jié)果顯示，AA-2βG在45 ℃下水解產(chǎn)率最高。在45 ℃下，考察了緩沖液pH值對β-葡萄糖苷酶(500 U/L)和AA-2βG(300 mmol/L)反應(yīng)(1 h)的影響，發(fā)現(xiàn)pH 5.0時酶活性最高。在45 ℃、pH 5.0的條件下，每隔15 min檢測AA-2βG水解的抗壞血酸的量，發(fā)現(xiàn)酶水解的適宜時間在45 min之內(nèi)。因此，確定β-葡萄糖苷酶水解AA-2βG的最佳條件為：緩沖液pH 5.0，反應(yīng)溫度45 ℃，反應(yīng)時間45 min。

2.5 β-葡萄糖苷酶的檢測

10 mmol/L的AA-2βG溶液與不同溶度的β-葡萄糖苷酶溶液反應(yīng)1 h后將體系pH值調(diào)至7.5，再加入刃天青繼續(xù)反應(yīng)，同時測量體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著β-葡萄糖苷酶濃度的增加，585 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，溶液從青藍(lán)色逐漸變成紫紅色，隨后變?yōu)榉奂t色。以溶液熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)酶濃度在1～30 U/L范圍內(nèi)，與溶液熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，線性方程為y=1.268 7x+37.636，相關(guān)系數(shù)r2=0.995，說明在此濃度范圍內(nèi)可對β-葡萄糖苷酶進(jìn)行定量檢測，根據(jù)IUPAC的定義計算，得出檢出限為1.0 U/L。

3 結(jié) 論

本文基于刃天青的還原機(jī)理，建立了一種β-葡萄糖苷酶活性檢測的新方法。以2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2βG)為底物，使之通過酶催化水解反應(yīng)生成抗壞血酸，后者將刃天青還原成具有強(qiáng)烈熒光的試鹵靈，通過熒光變化檢測β-葡萄糖苷酶的活性。該方法操作簡單，檢測靈敏度高，既可通過裸眼進(jìn)行定性檢測，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測，為β-葡萄糖苷酶的活性檢測提供了新方法。