趙一瑋，秦建華，李周原，王 靜，劉學(xué)瑞，董麗娜，徐 慧

(魯東大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

近年來，各種納米材料被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)方法檢測(cè)抗壞血酸(AA)[1-2]、多巴胺(DA)[3-4]、尿酸(UA)[5]等小分子物質(zhì)。其中，不同維度的碳材料和貴金屬材料，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)引起了人們的極大關(guān)注。多壁碳納米管(MWCNTs)是分子納米電子學(xué)的理想組成部分，具有優(yōu)異的平面導(dǎo)電性、較高的比表面積和非凡的力學(xué)性能[6-8]。然而，MWCNTs的分散能力較差，尤其在水中，這一缺點(diǎn)限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[9]。因此，提高M(jìn)WCNTs的水溶性勢(shì)在必行。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯(GO)可作表面活性劑來分散MWCNTs[10-11]，引起了廣泛關(guān)注。通常，當(dāng)加入GO后還需通過還原反應(yīng)，使其成為還原的氧化石墨烯(rGO)[12-14]，rGO具有導(dǎo)電性，可有效降低電荷轉(zhuǎn)移電阻而提高檢測(cè)靈敏度，但其存在還原方法復(fù)雜，還原劑多為有毒物等弊端[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，GO對(duì)AA[16]、DA[17]、UA[18]等分子具有很高的電催化性能，因此，將其與MWCNTs混合既可提高M(jìn)WCNTs的分散性，又能提高電化學(xué)效率，且無需使用還原劑，方法簡(jiǎn)單、環(huán)保。

金屬納米粒子具有較大的比表面積，可顯著提高電子轉(zhuǎn)移速率[19]，但金、鉑等貴金屬的高成本和稀缺性使提高其利用率成為研究重點(diǎn)[20-22]。金納米粒子(AuNPs)具有促進(jìn)電子傳遞速率的能力，已廣泛應(yīng)用于電催化研究中[23-25]。同時(shí)，鉑納米粒子是一種具有高催化作用的物質(zhì)，具有較高的催化作用。金鉑核殼納米粒子(Au@Pt NPs)由于其核和殼的協(xié)同作用和良好的催化性能[26]，在檢測(cè)過程中能顯示出更高的電流響應(yīng)、更高的穩(wěn)定性和持久性，已在醫(yī)療等眾多領(lǐng)域得到良好的應(yīng)用。

本研究將GO、MWCNTs和Au@Pt NPs 3種納米材料相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)GO能有效防止MWCNTs的聚集，并與其結(jié)合形成比表面積較大的三維納米材料[27]，可為Au@Pt NPs提供多維的附著位點(diǎn)，基于此，構(gòu)建了GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE電化學(xué)傳感器，將其用于AA的檢測(cè)，可獲得較寬的線性范圍和極低的檢出限，有望用于臨床檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

MWCNTs(純度>95%，中國(guó)深圳納米港有限公司)；六水合氯鉑酸(H2PtCl6·H2O，分析純，Pt≥37.5%，Addline公司)；四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)；葡萄糖(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸鈉(分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司)；抗壞血酸(分析純，天津市瑞金特有限公司)；鹽酸多巴胺(分析純，Sigma公司)；尿酸(分析純，Alfa Aesar公司)。其他試劑均為分析純，未經(jīng)提純直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電導(dǎo)率為18.25 MΩ·cm)。

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；JEM-1230型透射電子顯微鏡(TEM，日本日立公司)；電化學(xué)測(cè)量均在CHI-660C電化學(xué)工作站(上海市辰華儀器廠)上完成，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)三電極系統(tǒng)：裸玻碳電極(Bare GCE，直徑3 mm)或修飾的GCE為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl電極(3 mol/L KCl)為參比電極。

1.2 傳感器的構(gòu)建

1.2.1GO的制備按修改過的Hummers方法制備[28]GO。

1.2.2Au@PtNPs的制備首先用Frens法合成AuNPs[29]：取45 mL 1 mmol/L氯金酸溶液于三口燒瓶中，并搭建加熱回流裝置，將三口燒瓶放入磁力加熱攪拌套進(jìn)行加熱并攪拌，設(shè)置溫度270 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，加熱至沸騰。待HAuCl4溶液沸騰5 min后，將2 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液加入沸騰的HAuCl4·4H2O溶液中，再沸騰10 min，停止加熱，繼續(xù)攪拌15 min，配制完成。關(guān)閉攪拌，使其自然冷卻，冰箱冷藏放置。

再采用種子介導(dǎo)法合成Au@Pt NPs[30-31]：取2 mL合成的AuNPs加入25 mL潔凈燒杯中，加入450 μL 1.0 mmol/L六水合氯鉑酸溶液及660 μL超純水，于4 ℃條件下邊攪拌邊加入220 μL 10 mmol/L的硼氫化鈉溶液，持續(xù)攪拌30 min，得Au@Pt NPs。

1.2.3GO/MWCNTs混合液的制備將1 mg/mL的GO和1 mg/mL的MWCNTs水溶液混合后超聲4 h以上，制備成GO/MWCNTs混合溶液。

1.2.4GO/MWCNTs/Au@PtNPs/GCE傳感器的制備將GCE依次用1.0、0.3、0.05 μm Al2O3拋光成鏡面，用超純水清洗后分別在無水乙醇、用超純水中各超聲1 min，最后用N2吹干備用。用移液槍取5 μL 1 mg/mL GO/MWCNTs混合懸浮液滴涂在GCE電極表面，置于37 ℃烘箱中晾干，待電極表面成膜后，再將5 μL Au@Pt NPs滴涂在GO/MWCNTs/GCE表面，同樣置于37 ℃烘箱中晾干，層層組裝使電極表面再次成膜，此時(shí)，得到GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE傳感器。

1.3 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

電化學(xué)阻抗(EIS)測(cè)量：初始電位設(shè)置為開路電壓，頻率范圍為0.01～100 000 Hz，振幅5 mV，采用三電極系統(tǒng)在含5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 的0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行EIS分析。

差示脈沖伏安法(DPV)測(cè)量：在電勢(shì)范圍-0.4～0.4 V，靈敏度為1.0×10-4的條件下，將三電極系統(tǒng)浸于不同濃度AA的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中于1 min后進(jìn)行DPV測(cè)量。

循環(huán)伏安法(CV)測(cè)量：在-0.4～0.6 V范圍內(nèi)，于0.1 V/s掃速下(靈敏度為1.0×10-4)，將三電極系統(tǒng)置于含1 mmol/L AA溶液中進(jìn)行CV測(cè)量。

圖1 AuNPs(a)和 Au@Pt NPs(b)的紫外圖Fig.1 UV-Vis images of AuNPs(a) and Au@Pt NPs(b)synthetic wine red AuNPs (left) and Au@Pt NPs (right)

圖2 不同傳感界面的TEM圖Fig.2 TEM images of different materialsA:MWCNTs,B:GO/MWCNTs,C:AuNPs,D:Au@Pt NPs, E:GO/MWCNTs/Au@Pt NPs

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs與Au@Pt NPs的紫外光譜表征

Frens法合成的AuNPs溶液呈葡萄酒紅色，采用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)在519 nm出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)特征吸收峰(圖1曲線a)，此吸收峰為AuNPs的表面等離子共振所致，表明AuNPs已成功制備。當(dāng)加入六水合氯鉑酸和硼氫化鈉后，溶液顏色加深，相對(duì)于519 nm處AuNPs的特征峰發(fā)生略微紅移并伴隨著吸收峰展寬(圖1曲線b)。由此可見，Au@Pt NPs已成功合成。

2.2 電極修飾材料的透射電鏡形貌表征

采用透射電鏡(TEM)對(duì)碳納米管(MWCNTs)、氧化石墨烯/碳納米管(GO/MWCNTs)、金納米粒子(AuNPs)、金鉑核殼納米粒子(Au@Pt NPs)和氧化石墨烯/碳納米管/金鉑核殼納米粒子(GO/MWCNTs/Au@Pt NPs)的形貌進(jìn)行了表征(圖2)。結(jié)果顯示，MWCNTs呈互相纏繞的管狀結(jié)構(gòu)(圖2A)，直徑約10～20 nm，較大的比表面積利于Au@Pt NPs的附著；GO的結(jié)構(gòu)呈片狀分布形貌(圖2B)，有效防止了MWCNTs的團(tuán)聚，使MWCNTs呈現(xiàn)良好的分散性；通過檸檬酸鈉還原合成的AuNPs分散性良好，粒徑約13 nm(圖2C)；Au@Pt NPs核殼結(jié)構(gòu)粒徑稍微增大[32]，說明以 AuNPs 為核形成了Au@Pt NPs，展現(xiàn)了明顯的殼與核的對(duì)比(圖2D)。當(dāng)GO/MWCNTs和Au@Pt NPs結(jié)合后，Au@Pt NPs在傳感界面的附著明顯增加(圖2E)，納米粒子的多分散性將會(huì)增強(qiáng)傳感界面對(duì)AA的識(shí)別能力。

2.3 修飾電極的電化學(xué)特性表征

于含5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中，采用EIS對(duì)裸GCE、GO/GCE、Au@Pt NPs/GCE、MWCNTs/GCE、GO/MWCNTs/GCE、GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE進(jìn)行了研究(圖3A)，圖中直線部分表示擴(kuò)散過程，高頻處的半圓直徑顯示電荷轉(zhuǎn)移的電阻。結(jié)果顯示，裸GCE半圓較大，導(dǎo)電性能較差(曲線a)；GO/GCE半圓相對(duì)裸GCE較小(曲線b)，但其電荷轉(zhuǎn)移電阻仍較大。將Au@Pt NPs修飾在電極表面后(曲線c)，電極的電阻顯著減小，具有良好的導(dǎo)電性能。MWCNTs修飾電極(曲線d)的高頻處半圓基本消失，表明MWCNTs顯著促進(jìn)了電極表面電子的傳輸，具有良好的導(dǎo)電性。GO/MWCNTs修飾電極(曲線e)的高頻處的半圓又大于僅有MWCNTs時(shí)的半圓，說明GO/GCE導(dǎo)電性能弱于MWCNTs/GCE。GO/MWCNTs/Au@Pt NPs修飾電極(曲線f)的高頻處半圓遠(yuǎn)小于其它電極，基本接近直線，有力證明了GO/MWCNTs和Au@Pt NPs的協(xié)同作用使復(fù)合膜具有良好的導(dǎo)電性。

實(shí)驗(yàn)采用CVs考察了6支電極對(duì)相同濃度AA的電化學(xué)響應(yīng)(圖3B)。結(jié)果顯示，裸GCE對(duì)AA僅有微弱的響應(yīng)信號(hào)(曲線a)；修飾GO后，由于GO過多含氧官能團(tuán)的阻礙使氧化峰電流并沒有得到較大改善，因此其響應(yīng)電流僅產(chǎn)生少許增大和負(fù)移(曲線b)；采用Au@Pt NPs修飾電極后，氧化峰電流明顯增加，并且峰電位產(chǎn)生較大負(fù)移(曲線c)，顯示了Au@Pt NPs/GCE對(duì)AA的檢測(cè)具有相當(dāng)良好的催化效果。當(dāng)裸GCE上修飾MWCNTs后，氧化峰電流明顯增加且峰電位顯著負(fù)移(曲線d)，表明MWCNTs/GCE對(duì)AA具有很好的電催化性能。GO/MWCNTs/GCE(曲線e)與GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE(曲線f)相比，因大比表面積、優(yōu)異導(dǎo)電性能的GO/MWCNTs與Au@Pt NPs產(chǎn)生了協(xié)同作用，使得GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE對(duì)AA的響應(yīng)電流更加靈敏，與EIS研究結(jié)果一致。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1pH值的優(yōu)化pH值是影響電化學(xué)檢測(cè)的重要因素，因此需對(duì)電化學(xué)檢測(cè)AA過程中的pH值進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)采用CV考察了GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE在不同pH值(6.0、7.0、7.4、8.0、8.5)的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果顯示，隨著溶液pH值的增大，氧化峰電流呈先增大后急劇減小的趨勢(shì)，且在pH 7.4時(shí)達(dá)最大值，與人體實(shí)際pH值相符。由此可見，該GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE傳感器具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。

2.4.2掃速的影響掃速是影響電化學(xué)檢測(cè)的重要因素之一，不同的掃速會(huì)產(chǎn)生不同的電流值，還可通過掃速與電流的關(guān)系來判斷修飾電極反應(yīng)屬于擴(kuò)散控制還是表面吸附控制。實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法，考察了GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE對(duì)1.0×10-3mol/L AA在0.1～0.4 V/s掃速范圍內(nèi)的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果顯示，氧化峰電流值(Ip)與掃速(v，V/s)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Ip=213.31v+51.48，r=0.998，表明GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE表面的氧化過程屬于吸附控制。

2.5 選擇性研究

AA是人體中不可缺少的生物小分子物質(zhì)，在醫(yī)療檢測(cè)中十分重要，但人體中含有的UA、DA、葡萄糖等小分子物質(zhì)常會(huì)干擾其測(cè)定。實(shí)驗(yàn)將5×10-7mol/L AA與同濃度的其他小分子物質(zhì)(UA、DA、葡萄糖)分別混合在0.1 mol/L PBS緩沖溶液中(pH 7.4)，采用DPVs考察了GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE對(duì)AA的選擇性，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，加入干擾物質(zhì)前后電流響應(yīng)值差別不大，表明該修飾電極對(duì)AA具有良好的選擇性。

2.6 重現(xiàn)性及穩(wěn)定性

平行制備5根GO/MWCNTs/Au@Pt NPs修飾電極，在優(yōu)化條件下測(cè)定AA，得5支修飾電極的氧化峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%，表明該修飾電極具有良好的重現(xiàn)性；將電極保存于4 ℃冰箱中，7 d后取出再次測(cè)定AA，氧化峰電流為初始的94.5%，表明電極的穩(wěn)定性良好。

2.7 最優(yōu)條件下不同濃度AA在新型傳感界面的DPV響應(yīng)

在優(yōu)化條件下，于-0.4～0.4 V電位范圍內(nèi)考察了GO/MWCNTs/Au@Pt NPs/GCE對(duì)不同濃度AA的DPV響應(yīng)。結(jié)果顯示，氧化峰電流(Ip,μA)與AA濃度(c,μmol/L)在0.5～1 000 μmol/L和0.005～0.5 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為IPC=0.079 12c+2.558 62(r=0.999)、IPC=3.435c+0.870 7(r=0.999)。根據(jù)低濃度線性范圍區(qū)間，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得該傳感器對(duì)AA的檢出限(LOD)為4.0×10-9mol/L。

將本研究所制備GO/MWCNTs/Au@Pt NPs修飾電極與已報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行比較(表1)。結(jié)果顯示，本文制備的傳感器具有極低的檢出限和極寬的線性范圍。進(jìn)一步表明實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的新型傳感界面對(duì)檢測(cè)AA具有優(yōu)越的靈敏度和良好的響應(yīng)效果。

表1 不同修飾電極檢測(cè)AA的分析性能比較Table 1 Comparison of reported various electrochemical sensors and this study for the detection of AA

PANI(聚苯胺)，3DNNCsHAs(具有層次結(jié)構(gòu)的三維氮化納米結(jié)構(gòu)碳)，羧化多壁碳納米管(c-MWCNT)，PIG(聚乙烯醇和氧化鐵石墨烯)，PANI(聚苯胺)，CuPc(銅(Ⅱ)酞菁)，SPE(絲網(wǎng)印刷電極)

2.8 準(zhǔn)確度與精密度

為了研究此方法構(gòu)建的新型傳感界面對(duì)AA檢測(cè)在實(shí)際樣品中的應(yīng)用，將100 μL的血清分別加入10、0.1、0.01 μmol/L的AA中，采用本研究制備的GO/MWCNTs/Au@Pt NPs修飾電極在優(yōu)化條件下進(jìn)行DPVs測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為90.9%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)為1.2%～2.8%。表明該GO/MWCNTs/Au@Pt NPs電化學(xué)傳感器準(zhǔn)確度與精密度良好，有望應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文成功構(gòu)建了一種基于GO/MWCNTs/Au@Pt NPs的新型電化學(xué)傳感界面。基于MWCNTs較大的比表面積和良好的導(dǎo)電效果，加入GO防止MWCNTs聚集。GO/MWCNTs界面與具有良好電催化性能的Au@Pt NPs協(xié)同作用。多種納米粒子層層組裝大大增加了修飾界面對(duì)AA檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性。該方法對(duì)AA的檢測(cè)具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性優(yōu)良、操作簡(jiǎn)易、成本低的優(yōu)點(diǎn)，可望應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域。