羅 丹,周光明*，陳 蓉，羅慶紅,郝光輝

(1.發(fā)光與實(shí)時分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400715；2.隆昌市環(huán)境監(jiān)測站,四川 隆昌 642100 )

阿斯巴甜(APM)是一種人工甜味劑，因其熱量低、體內(nèi)不代謝且制造成本低、甜度高等優(yōu)點(diǎn),被作為甜味劑廣泛使用于糖果、軟飲料、果脯及糕點(diǎn)等食品。近年來，軟飲料，尤以蘇打水、可樂、雪碧、芬達(dá)等為代表受到了廣大消費(fèi)者的喜愛[1]，但甜味劑的過量攝入可能會造成人體肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)破壞，以及導(dǎo)致肥胖、2型糖尿病(T2D)、代謝癥候群、高血壓以及心血管疾病[2]。研究還表明：APM在老鼠體內(nèi)會分解為天冬氨酸、苯丙氨酸及甲醇，是一種潛在的致癌劑[3]。世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)合委員會確定，APM的可接受攝入量為50 mg/kg體重，軟飲料含APM的最高允許水平為600 mg/L[4-5]，因此很有必要建立對APM的檢測方法。

目前，關(guān)于APM的檢測方法有高效液相色譜法[6-7]、流動注射法[8]、循環(huán)伏安法[9]。盡管此類方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,但存在很大的缺陷，如需要對樣品進(jìn)行繁瑣的預(yù)處理，成本高，流動相需使用大量有機(jī)溶劑，檢測時間長且對儀器的耗損較大。熒光法[10]、分子印跡法[11]及毛細(xì)管電泳法[12]也被用于APM的檢測，但這些方法也存在缺點(diǎn),如需長達(dá)幾個月的時間尋找適合的熒光探針或抗體,且熒光探針、抗體和酶聯(lián)劑易受到實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度及pH值的影響。因此建立一種無損、快速、環(huán)境污染小的適合大批量樣品的現(xiàn)場分析方法，并適用于糖類食品等復(fù)雜基體中甜味劑的定量檢測極其重要。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是一種基于單色入射光對光子和分子進(jìn)行非彈性散射的具有強(qiáng)大吸引力的無損實(shí)時振動光譜技術(shù),通常采用金、銀等貴金屬來增強(qiáng)拉曼散射。該方法因檢測周期短、無損、基體干擾小、污染少等特點(diǎn)，在食品、藥品、環(huán)境、衛(wèi)生等領(lǐng)域受到熱切關(guān)注。本文利用超聲技術(shù)輔助預(yù)處理，使用納米銀為活性基底，優(yōu)化納米銀與APM溶液的pH值、混合體積比、混合溫度及加熱時間等實(shí)驗(yàn)條件，建立了對軟飲料中APM進(jìn)行無損分析的SERS方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與儀器

阿斯巴甜(APM,98%，阿拉丁試劑公司(上海))；硝酸銀、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三氯化鐵、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸(分析純，四川科龍?jiān)噭┯邢薰?；甲醇(色譜純，四川科龍?jiān)噭┯邢薰?；蘇打水、可樂、雪碧、芬達(dá)均從重慶當(dāng)?shù)匾患页匈徺I;實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

激光顯微拉曼光譜儀:英國Renishaw公司，激發(fā)波長為633 nm，激光強(qiáng)度為10 mW，積分時間為30 s，檢測波長范圍：0～3 000 cm-1。高效液相色譜儀：島津LC-20A，色譜柱：Phenomenex C18，柱溫：35 ℃，流速：0.500 m L/min，流動相：甲醇-水。

1.2 納米銀的制備

按照文獻(xiàn)方法并稍加改進(jìn)后制備納米銀[13]：將PVP 溶于乙二醇中，配制0.56 mol/L PVP 溶液。取50 mL 0.56 mol/L PVP 溶液至100 mL燒杯，加入磁力攪拌器攪拌同時油浴加熱至150 ℃，保持溫度恒定，加入110 μL 0.15 mmol/L FeCl3溶液，5 min后，加入100 μL 0.15 mol/L NaCl 溶液，5 min后再加入10 mL 0.15 mol/L AgNO3。為了從納米銀中分離出過量的PVP，將制取液用乙醇稀釋，并以4 000 r/min離心，將上清液分散在乙醇中置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 溶液的配制及測定

將蘇打水、可樂、雪碧、芬達(dá)置于燒杯中超聲洗脫1 h后排盡CO2。準(zhǔn)確稱取APM粉末溶于水、蘇打水、雪碧、可樂、芬達(dá)中，配制1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液及基質(zhì)加標(biāo)液，并逐級稀釋至100、80、50、20、10、0.5 mg/L，常溫下保存，備用。 取上述配制溶液與納米銀按照1 ∶ 1混合 20 min后，滴在玻片上待測，并根據(jù)拉曼峰強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀的表征

由于納米粒子的尺寸、表面粗糙程度等因素會影響其光學(xué)性質(zhì)，因此采用紫外光譜(UV/Vis)和透射電子顯微鏡(TEM)對鈉米銀進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，納米銀的紫外吸收峰在589 nm左右(圖1A)，表明其對應(yīng)直徑約為100 nm。TEM圖(圖1B)則顯示制備的納米銀為較均勻的球形顆粒，且比表面積大，有助于使APM分子吸附更均勻，拉曼信號更穩(wěn)定。

圖 1 納米銀的紫外吸收光譜(A)及透射電子顯微鏡圖(B)Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum(A)and TEM image(B) of silver nanoparticles

2.2 APM的拉曼光譜和待測樣品的SERS譜圖分析

NRS(cm-1)SERS(cm-1)Vibration mode attributionNRS(cm-1)SERS(cm-1)Vibration mode attribution490τ(C—C—C)1 1961 204νs(C—N)621621ω(C—H)1 273τ(CH2)747,765746ν(C—C)1 3551 382τ(CH2)817νs(C—C—O)1 403,1 4461 426,1 492τ(CH2)887848ω(C—H)1 584,1 6031 604ν(C‖C)931933,969ω(CH3)1 6641 667ν(C‖O)1 0011 001環(huán)呼吸振動1 735ν(C‖O)1 0311 031νs(C—O—C)2 9492 928ν(C—H)1 125,1 158νas(C—O)3 0623 062ν(C—H)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲取最佳檢測條件，采用單因素對混合溶液pH值、混合比例、混合溫度及加熱時間等因素對特征峰的影響進(jìn)行考察。

圖3 APM在不同pH值下的SERS譜圖Fig.3 SERS spectra of APM at different pH values

2.3.1pH值的選擇酸堿度差異對APM電離程度、特征峰強(qiáng)度及吸附位置均有影響。因此，考察了100 mg/L APM標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH值的SERS增強(qiáng)效果。由圖3可知，pH值大于7.0時，拉曼峰特征清晰，但1 001 cm-1處的強(qiáng)度比弱酸性和中性時更小。此外，由于APM水解后pH值為5.0且在pH 3.0 ～ 5.0時較穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為5.0。

2.3.2納米銀與APM體積比的優(yōu)化總體積不變條件下，分別考察了納米銀與APM的最佳體積比為1 ∶ 4、1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1時的SERS光譜。結(jié)果顯示，隨著混合體積比從1 ∶ 4升至1 ∶ 1再升至3 ∶ 1，APM的拉曼特征峰強(qiáng)度光逐漸增大之后又減小，因此實(shí)驗(yàn)選擇納米銀與APM的最佳體積比為1 ∶ 1。這可能是由于早期APM的量過大時，導(dǎo)致納米銀被過于包裹從而使得電子躍遷概率下降，但納米銀的量過多時，易導(dǎo)致納米銀團(tuán)聚而使得SERS信號減弱。

2.3.3混合溫度與加熱時間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)溫度會影響APM粒子對納米銀的吸附，因此考察了100 mg/L APM溶液在不同溫度下的SERS響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：隨著溫度的不斷上升，1 001 cm-1處的特征峰強(qiáng)度變化趨勢較小，為保持體系的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)選擇30 ℃為最佳混合溫度。為選擇理想的加熱時間，考察了加熱時間對特征峰強(qiáng)度的動力學(xué)曲線。將 100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液置于30 ℃油浴鍋中，連續(xù)采集一系列加熱時間的SERS光譜。結(jié)果表明，當(dāng)加熱時間由2 min增至6 min，SERS的特征峰強(qiáng)度不斷上升，但當(dāng)超過6 min后，特征峰強(qiáng)度反而下降，這可能是因?yàn)闀r間過長導(dǎo)致納米銀產(chǎn)生團(tuán)聚，使SERS信號產(chǎn)生衰減所致。因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳加熱時間為6 min。

2.4 APM的定量分析

以水以及蘇打水、雪碧、可樂、芬達(dá)為溶劑配制一系列濃度(0.5、10、20、50、80、100 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)加標(biāo)溶液，并進(jìn)行SERS掃描，運(yùn)用線性回歸法，繪制以溶液濃度(x，mg·L-1)對應(yīng)1 001 cm-1處信號強(qiáng)度(y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，部分譜圖見圖4，線性結(jié)果如表2所示。APM在0.5～100 mg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其中在蘇打水、雪碧、可樂和芬達(dá)中的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.974 7～0.984 8，純品中的r2為0.993 3。對0.5 mg/L APM標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定12次，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到檢出限為0.41 mg/L。與筆者按GB5009.263-2016法采用HPLC進(jìn)行測定的結(jié)果(y=37 361x+712 422，r2=0.999 1)相比，本方法在靈敏度上存在一定的差距，其原因可能是待測樣品中所含色素或其他添加劑干擾所致。此外，若使用的活性基底不均勻，也會降低實(shí)際樣品的靈敏度。但由于HPLC前處理繁雜，需使用大量有機(jī)溶劑，同時洗脫時間較長，對儀器損耗較大，因此SERS在節(jié)約成本、無損、快速等方面存在巨大潛力。

MatriceLinear range(mg/L)Linear equationr2Water0.5～100 y=1 131x+973.60.993 3Soda0.5～100 y=30.44x+104.30.984 6Sprite0.5～100 y=20.99x+79.530.984 4Cola0.5～100 y=21.02x+109.80.974 7Fanta0.5～100y=42.70x+93.860.984 8

2.5 軟飲料中APM的檢測

將購買的軟飲料(蘇打水、可樂、雪碧、芬達(dá))按照本方法進(jìn)行預(yù)處理后，向其分別添加10.0、20.0、50.0 mg/L 濃度水平的APM標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC法及本方法進(jìn)行測定，并計(jì)算其平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。表3結(jié)果顯示，利用SERS法測得4種飲料中APM的平均回收率為88.4%～ 121%，RSD為2.6%～6.4%；HPLC法測得回收率為99.5%～108%，RSD為2.1%～4.6%。盡管SERS法的回收率和RSD與HPLC法相比存在一定差距，但該方法預(yù)處理1個樣品需1 h,檢測約1 min，而HPLC法預(yù)處理1個樣品需2 h，檢測需15 min，這充分體現(xiàn)了SERS法的快速優(yōu)勢。此外，實(shí)際樣中可樂的回收率最低，可能是由于可樂顏色較深，其中色素等雜質(zhì)干擾了SERS測試。目前已有報(bào)道利用SERS技術(shù)對奶粉中的非法添加劑[16]，及食品中的著色劑進(jìn)行檢測[17-18]，但分析更為復(fù)雜的實(shí)際樣品(如肉類、服飾)中的違禁成分時，其靈敏度和檢出限還需進(jìn)一步提高。因此，進(jìn)一步優(yōu)化SERS檢測的前處理方法，縮短前處理時間，以獲得均勻的基底和均一的吸附角度將是SERS的研究重點(diǎn)。

表3 樣品分析及加標(biāo)回收結(jié)果Table 3 Analytical results and recoveries of sample

3 結(jié) 論

本文借助超聲輔助技術(shù)對軟飲料進(jìn)行預(yù)處理，通過優(yōu)化納米銀與APM溶液的pH值、混合體積比、混合溫度及加熱時間等SERS條件。在優(yōu)化條件下，運(yùn)用SERS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量方法對水及軟飲料中APM進(jìn)行定量檢測。測得水中r2為0.993 3，檢出限為0.41 mg/L，軟飲料中r2為0.974 7 ～ 0.984 8，回收率為 88.4 %～ 121%。相比于HPLC法，SERS技術(shù)檢測軟飲料中APM濃度時在靈敏度和回收率方面還存在不足，但可避免使用大量有機(jī)溶劑，減少了環(huán)境污染，同時檢測速度快、無損，適用于簡單成分大批量樣品的現(xiàn)場實(shí)時分析。該方法的建立為SERS技術(shù)在食品中化學(xué)添加劑的檢測及開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。