劉文靜，余海霞，嚴忠雍，張小軍*，丁國芳

(1.浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江大學(xué) 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021)

黃曲霉毒素(AFs)由黃曲霉、寄生曲霉兩類霉菌代謝產(chǎn)生，是一類結(jié)構(gòu)相似且含多環(huán)不飽和香豆素的化合物[1]。目前已分離出17種AFs，其中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)常見于玉米[2-5]、水稻[4]、堅果[4]、香料[5]和牛奶[6]等各類食品和飼料[7]中。AFs對絕大多數(shù)養(yǎng)殖動物具有致死毒性、致畸性和致癌性，并對免疫和生殖系統(tǒng)具有損傷性[8]。研究表明，AFs普遍存在于水產(chǎn)飼料中，并在水產(chǎn)生物體內(nèi)累積，顯著破壞水產(chǎn)生物的健康和質(zhì)量，從而對消費者的公共衛(wèi)生健康產(chǎn)生潛在危害[9]。因此需要加強對水產(chǎn)飼料中AFs的檢測和監(jiān)控，以進一步提高水產(chǎn)品品質(zhì)和保障消費者安全。

目前常用的AFs檢測方法有薄層色譜法[10]、酶聯(lián)免疫法[11-13]、熒光光度法[14-15]、高效液相色譜法[ 16-19]等。但上述方法的靈敏度相對較低，且易出現(xiàn)假陽性等問題，因此在應(yīng)用方面受到限制。近年來，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)[20-22]由于靈敏度高、定性準確而被廣泛應(yīng)用于飼料檢測，但由于水產(chǎn)飼料基質(zhì)復(fù)雜，亟需開發(fā)專一性強、凈化效果好的前處理方法以獲得更好的定性、定量效果。免疫親和色譜柱凈化是利用抗原和抗體特異性結(jié)合原理的一種新型高效的前處理方法，近年來在食品檢測特別是單一目標物的前處理領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[23]，但針對多組分凈化的文獻少見報道。本研究利用多組分免疫親和柱凈化建立特異性前處理方法，結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)建立了水產(chǎn)飼料中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢測方法。該法靈敏度高、快速準確，適用于水產(chǎn)飼料中AFs的檢測和監(jiān)控。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

AFs混合標準品(純度≥98.0%，美國Supelco公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(分析純，美國Sigma公司)；氯化鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q純水器制備的超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

AcquityTM超高效液相色譜儀、Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；MS2旋渦混合器(德國IKA公司)；Centrifuge 5810高速離心機(德國Eppendorf公司)；電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco公司)；AFs總量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)免疫親和柱(柱容量1 mL，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)；超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；微孔濾膜(0.22 μm，津騰公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1溶液的配制AFs標準溶液：用 1 000 μL移液槍準確移取1.0 mL AFs標準品，以甲醇稀釋并定容至4 mL，AFB1、AFG1的質(zhì)量濃度為225 ng/mL,AFB2、AFG2的質(zhì)量濃度為75 ng/mL，于4 ℃避光保存。將標準溶液分別以0.1%甲酸-乙腈(體積比4 ∶ 1)逐級稀釋至所需濃度，制得中間液和使用液。

1.2.2樣品提取準確稱取(2±0.01) g粉碎樣品(過1 mm分樣篩)于50 mL離心管中，加入2.0 mL水后渦旋混合60 s。加入0.4 g氯化鈉與10 mL 80%(體積分數(shù))乙腈水，渦旋混勻，超聲提取10 min,6 000 r/min 離心3 min。取上清液經(jīng)濾紙過濾，取2 mL濾液于15 mL離心管中，加入8 mL水稀釋，渦旋混合30 s，5 000 r/min離心3 min待凈化。

1.2.3多組分免疫親和柱凈化免疫親和柱恢復(fù)至室溫后去掉親和柱堵頭，待柱內(nèi)保存液排干后，將上述10 mL上樣液以1～2 滴/s的流速過柱。上樣結(jié)束后，用10 mL 24%(體積分數(shù))乙腈水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，棄去全部流出液。用2 mL 1%甲酸甲醇溶液以1滴/s的流速洗脫，洗脫液收集于 15 mL離心管，于50 ℃水浴中氮氣吹干，加入1.0 mL初始流動相溶解并渦旋混合30 s，過0.22 μm有機相濾膜后，待測。

1.2.4色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)；進樣量為10.0 μL；樣品室溫度為10 ℃，柱溫為40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速為0.25 mL/min。梯度洗脫程序：0～2 min，80%～20%A；2～3 min，40%～60%A；3～5 min，80%A。

1.2.5質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子掃描模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測；毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為380 ℃，流速為550 L/h；錐孔氣流速為50 L/h，錐孔氣與脫溶劑氣均為高純氮氣。4種AFs的MRM實驗條件如表1所示。

*quantitative ion

圖1 飼料樣品加標的色譜圖Fig.1 Chromatograms of feed sample fortified with standardsAFB1 and AFG1 spiked 1.5 μg/kg；AFB2 and AFG2 spiked 0.5 μg/kg

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的優(yōu)化在ESI+模式下，流動相中加0.1%甲酸有利于化合物的離子化，并可改善色譜峰形。AFs易溶于乙腈，且具有較好的響應(yīng)值，實驗通過優(yōu)化水相(0.1%甲酸)與有機相(乙腈)的比例，發(fā)現(xiàn)在“1.2.4”的洗脫梯度下能得到良好的色譜分離效果，出峰時間適中，峰形尖銳對稱，且目標峰附近無明顯雜峰。故選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相，在該條件下飼料樣品加標的色譜圖見圖1，其中AFB1、AFG1加標水平為1.5 μg/kg，AFB2、AFG2加標水平為0.5 μg/kg。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化AFs在ESI+模式下具有較高的響應(yīng)強度，將AFs標準溶液(AFB1、AFG1質(zhì)量濃度為225 ng/mL,AFB2、AFG2為75 ng/mL)以20 μL/min的流速注入離子源，對質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。在一級質(zhì)譜全掃描分析中，選擇豐度最高的離子作為AFs的特征離子，調(diào)試優(yōu)化出最佳錐孔電壓和毛細管電壓。經(jīng)過二級碰撞誘導(dǎo)分析收集分析物的子離子信息，并對碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，選擇響應(yīng)最強的離子作為定量離子，響應(yīng)次強的離子作為定性離子。最終確定4種AFs的質(zhì)譜參數(shù)如“1.2.5”所示。

2.2 提取劑的選擇

實驗發(fā)現(xiàn)，飼料樣品中先加入2 mL水浸潤后再采用有機溶劑提取，能有效避免因飼料吸收提取液導(dǎo)致的提取不充分，可提高方法的回收率。由于高有機相比例的提取劑對飼料樣品的效果最好，因此分別考察了70%甲醇水、80%乙腈水和純乙腈作為提取劑時對4種AFs的提取效果。結(jié)果顯示，采用70%甲醇水作為提取劑的提取率為28.5%～89%；純乙腈作為提取劑的提取率為63%～82%；而采用80%乙腈水作為提取劑的效果最好，提取率為72.1%～95.4%。且采用80%乙腈水可使提取液分層明顯，有利于后續(xù)實驗操作，顯著提高了實驗效率，因此選擇80%乙腈水為提取劑。

2.3 免疫親和柱條件的優(yōu)化

在多組分殘留測定中，淋洗液和洗脫液會影響免疫親和柱的效果，因此對淋洗液和洗脫液進行了優(yōu)化。分別比較了純甲醇、24%甲醇水、24%乙腈水的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)24%乙腈水的淋洗效果最好，且4種AFs的凈化效果隨著淋洗體積的增大而逐漸提高，最終確定采用10 mL 24%乙腈水進行淋洗。

文獻[14-16]多采用純甲醇進行洗脫，本研究考察了純甲醇、初始流動相、乙腈、1%氨水甲醇、1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈、0.2%甲酸甲醇、0.5%甲酸甲醇、1%甲酸甲醇的洗脫效果，將50 ng/mL的AFB1、AFG1以及15 ng/mL的AFB2、AFG2標準溶液直接上樣，每1 mL洗脫液收集1次，共收集3 次。結(jié)果表明，對于上述9種洗脫液，第3 mL洗脫液中均基本未檢出目標物，表明2 mL洗脫液即可將免疫親和柱上的AFs完全洗脫，因此取2 mL洗脫液進行洗脫。相比之下，以1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈、1%甲酸甲醇洗脫的效果較好，4種AFs的回收率分別為84.8%～91.1%、99.1%～113%和97.7%～113%，由于在濃縮過程中1%甲酸甲醇更節(jié)約時間，故選擇2 mL 1%甲酸甲醇作為洗脫液。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)是指基質(zhì)中除分析物以外的其他成分對測定值的影響，是考察分析方法抗干擾能力的有效指標。實驗在空白基質(zhì)中分別添加一定量的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，采用本方法進行分析，計算空白基質(zhì)中目標物響應(yīng)值與純?nèi)軇┲许憫?yīng)值的比值，得到本方法的ME值為93.6%～104.3%，表明不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

準確量取AFs標準溶液，配制AFB1、AFG1質(zhì)量濃度為2.25、4.5、9.0、10.0、22.5 ng/mL(AFB2、AFG2質(zhì)量濃度為0.75、1.5、3.0、6.0、7.5 ng/mL)的標準溶液，采用本方法進行測定，以定量離子的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸；以3倍信噪比(S/N=3)時的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，以S/N=10時的樣品濃度為方法定量下限(LOQ)。得到AFB1、AFG1和AFB2、AFG2分別在2.25～22.5 ng/mL和0.75～7.5 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.997；AFB1、AFG1的LOD和LOQ分別為0.3 μg/kg和0.7 μg/kg；AFB2、AFG2的LOD和LOQ分別為0.1 μg/kg和0.2 μg/kg(見表2)，本方法的LOQ低于文獻報道值[24-29]。

表2 4種AFs的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差Table 2 Linear relationships,detection limits,quantitation limits,recoveries and RSDs of four AFs

圖2 AFB1和AFB2陽性樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of AFB1 and AFB2 positive sample

2.6 方法回收率與相對標準偏差

稱取30份飼料樣品，每份(2±0.01) g，均添加80 μL的4種AFs混合標準溶液(AFB1、AFG1的質(zhì)量濃度為225 ng/mL；AFB2、AFG2的質(zhì)量濃度為75 ng/mL)。按照本方法重復(fù)測定6次，持續(xù)測定5 d，并分別計算平均回收率、日內(nèi)相對標準偏差(RSD)和日間RSD。結(jié)果顯示，4種AFs的平均回收率為78.7%～85.5%，日內(nèi)RSD為6.0%～6.5%，日間RSD為6.6%～7.0%(見表2)。

2.7 實際樣品分析

采用建立的方法對市售魚、蝦等水產(chǎn)飼料各25個樣品進行檢測，其中5個樣品檢出AFB1，含量為0.320～1.813 μg/kg,1個香魚飼料檢出AFB2，含量為0.136 μg/kg。結(jié)果表明，目前水產(chǎn)飼料所含的AFs主要為AFB1和AFB2。另對本實驗室常規(guī)存儲的樣品每2 d檢測1次，發(fā)現(xiàn)AFB1和AFB2的含量均隨著貯存時間的延長而增加，第10 d后上述50種樣品均檢出AFB1和AFB2，典型的陽性樣品色譜圖如圖2所示。

3 結(jié) 論

本研究建立了水產(chǎn)飼料中4種AFs的免疫親和柱凈化/UPLC-MS/MS檢測方法，在優(yōu)化條件下方法的檢出限為0.1～0.3 μg/kg，定量下限為0.2～0.7 μg/kg，平均回收率為78.7%～85.5%，日內(nèi)RSD為6.0%～6.5%，日間RSD為6.6%～7.0%。對市售50種水產(chǎn)飼料進行了檢測，檢出6個陽性樣品，主要為AFB1和AFB2，其含量為0.136～1.813 μg/kg。該方法特異性強、抗干擾能力好，且靈敏度和精密度較高，可廣泛用于水產(chǎn)飼料等復(fù)雜基質(zhì)中AFs的檢測。