王 敏，孟 爽，谷夢(mèng)巧，遲寬能，馬玉嬋，鄧 燕，李德蕾，張 茜，胡 蓉，楊云慧

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

卟啉化合物是一類大環(huán)共軛芳香骨架化合物，其母體化合物稱為卟吩，有取代基的卟吩則稱為卟啉。卟啉環(huán)是一個(gè)高度共軛的系統(tǒng)，有26個(gè)π電子，故外觀呈黑色。許多卟啉以與金屬離子配合的形式存在于自然界中，如含有二氫卟吩與鎂配位結(jié)構(gòu)的葉綠素以及與鐵配位的血紅素[1]。這些物質(zhì)都參與了動(dòng)植物的重要生命活動(dòng)。同時(shí)，該類化合物良好的光、熱穩(wěn)定性以及優(yōu)越的物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和其它性能，使得卟啉化學(xué)得到了很好的發(fā)展。卟啉化合物的光電性能使之可用于光電傳感器的研制。

C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive protein，CRP)是外界對(duì)系統(tǒng)的刺激在肝臟中產(chǎn)生的一種急性期蛋白質(zhì)[2]，是人類不同炎癥過程和組織損傷的眾所周知的診斷生物標(biāo)志物[3-4]，甚至是心臟病發(fā)作、心律不齊以及猝發(fā)中風(fēng)的前兆[5]物質(zhì)。CRP是一個(gè)可靠的用于判斷組織破壞、細(xì)胞壞死和炎癥的參考指標(biāo)，其生物學(xué)半衰期不會(huì)因?yàn)闄C(jī)體的年齡、肝臟或腎臟功能、藥物治療而受到影響。新的標(biāo)準(zhǔn)化CRP分析為慢性炎癥疾病的縱向檢測(cè)提供了可能性，并且可幫助診斷并發(fā)癥[6]。傳統(tǒng)的CRP檢測(cè)方法有乳膠凝集實(shí)驗(yàn)[7]、放射免疫法[8]、酶聯(lián)吸附法[9]等，但這些方法存在需使用大型儀器、價(jià)格昂貴、樣品用量大等缺點(diǎn)，因此，發(fā)展靈敏、準(zhǔn)確、快速、節(jié)省樣品的CRP的檢測(cè)方法在臨床上具有重要意義[10-11]。

從電化學(xué)方法演變而來的光電化學(xué)是一門蓬勃發(fā)展的學(xué)科，自貝克勒爾1839年發(fā)現(xiàn)光電效應(yīng)以來[12-14]，光電化學(xué)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。光電化學(xué)過程是指分子、離子或半導(dǎo)體材料等因吸收光子而使電子受激發(fā)產(chǎn)生電荷傳遞，從而實(shí)現(xiàn)光能向電能轉(zhuǎn)化的過程。具有光電化學(xué)活性的物質(zhì)受光激發(fā)后發(fā)生電荷分離或電荷傳遞過程，從而形成光電壓或者光電流[15]。光電化學(xué)傳感器是利用具有光電活性的物質(zhì)來檢測(cè)待測(cè)物的傳感裝置[16]。在光電化學(xué)傳感中，光作為激發(fā)源，光電流被記錄為檢測(cè)信號(hào)。光電化學(xué)過程的激發(fā)信號(hào)和檢測(cè)信號(hào)完全分離，使得傳感系統(tǒng)具有高的靈敏度和低的背景信號(hào)，特別適用于低濃度生物分子的測(cè)定[17]。此外，光電化學(xué)傳感系統(tǒng)還具有電化學(xué)傳感器方便、低成本、快速且易于使用的固有特性，已被廣泛應(yīng)用于生物傳感和生物分析[18]。

近年來，貴金屬納米顆粒材料因生物相容性良好、易于合成、化學(xué)穩(wěn)定性好、比表面積大等特點(diǎn)[19-20]以及優(yōu)異的電導(dǎo)率和表面等離子體共振效應(yīng)[21-22]，在增強(qiáng)光電化學(xué)傳感器的光電流響應(yīng)方面得到了有效應(yīng)用。本文采用低成本方法合成卟啉多孔化合物(PAF)，并利用摻雜金納米顆粒的卟啉多孔化合物研制了一種以金納米顆粒為催化劑的無標(biāo)記型光電免疫傳感器用于CRP的快速檢測(cè)，通過檢測(cè)光電響應(yīng)值實(shí)現(xiàn)了對(duì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)的無標(biāo)記型定量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PEAC 200A型光電化學(xué)反應(yīng)儀、ITO玻璃片(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)；CHI660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；TGL-20M離心機(jī)(湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司)。

間-四苯基卟吩(C44H30N4，97%)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；三氯甲烷(CHCl3)和鹽酸(HCl)購(gòu)于重慶川東化工有限公司；六水合氯化鋁(AlCl3·6H2O)、無水乙醇(C2H5OH)、甲醇(CH3OH)、30%過氧化氫(H2O2)、磷酸緩沖溶液(PBS,pH 7.4)、殼聚糖、牛血清蛋白(BSA)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；氯金酸(HAuCl4)購(gòu)于昆明鉑銳金屬材料有限公司;C-反應(yīng)蛋白抗體(anti-CRP)、C-反應(yīng)蛋白抗原(CRP)購(gòu)于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；丙酮(C3H6O)購(gòu)于云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。

1.2 PAF的合成

參考文獻(xiàn)合成PAF[1]。稱取間-四苯基卟吩(385 mg,0.62 mmol)和AlCl3(3.00 g,4.5 mmol)置于100 mL兩頸圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下向圓底燒瓶中加入40 mL干燥的三氯甲烷，60 ℃油浴下反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，攪拌冷卻至室溫，離心收集粗產(chǎn)物。將得到的粗產(chǎn)物分別用無水乙醇、3 mol/L的HCl和甲醇洗滌3次，之后將產(chǎn)物在120 ℃真空中干燥，得到黑色粉末，即為PAF。

1.3 金納米顆粒的合成

參照文獻(xiàn)[23]合成金納米顆粒。在100 mL潔凈、干燥的三頸圓底燒瓶中加入50 mL去離子水和1%500 μL的氯金酸，混合均勻，在攪拌下加熱至沸騰后(180 ℃)，加入1.75 mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱15 min，直至溶液變成酒紅色的金溶膠，即得金納米顆粒的分散溶液。

1.4 Au NPs@PAF的合成

稱取50 mg PAF固體顆粒分散到25 mL去離子水中，超聲數(shù)分鐘使其分散均勻，再取15 mL “1.3”中合成的納米金溶膠加入到該混合溶液中，攪拌24 h使金納米顆粒被PAF充分吸附，離心后用去離子水洗滌3次，真空干燥后得到Au NPs@PAF。

1.5 光電免疫傳感器的制備

將ITO玻璃片分別用丙酮、高溫滅菌水和無水乙醇超聲5 min，自然晾干。將2 mg/mL Au NPs@PAF與殼聚糖(CHIT)等體積混合均勻后，取10 μL滴在處理好的ITO玻璃片上，然后滴加10 μL 50 μg/mL的C-反應(yīng)蛋白抗體，于37 ℃恒溫培育1 h，隨后滴加10 μL 1%BSA以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，培育1 h，用滅菌水沖洗未吸附的BSA，晾干后滴加10 μL不同濃度的C-反應(yīng)蛋白，培育1 h后晾干。最后在常溫下，于電解池中分別加入4 mL PBS緩沖溶液和10 μL過氧化氫(100 mmol/L)，并將晾干的ITO玻璃片固定在電解池中，以0.7 V的電壓測(cè)量光電響應(yīng)電流值。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理及方法

圖1 光電免疫傳感器的制備流程Fig.1 Preparation procedure of the photoeletrochemical immunosensors

圖2 Au NPs@PAF的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of Au NPs@PAF

卟啉多孔化合物PAF具有良好的光電響應(yīng)，與金屬納米顆?；旌虾笃涔怆婍憫?yīng)值增強(qiáng)，同時(shí)該混合物可作為固定基質(zhì)固定C-反應(yīng)蛋白抗體，本文通過在其上滴加CRP進(jìn)行培育。由于形成的免疫復(fù)合物可阻礙電子傳遞，導(dǎo)致光電流響應(yīng)減小，電流減小的程度與CRP的濃度成反比，從而制得無標(biāo)記型光電免疫傳感器。本實(shí)驗(yàn)以PBS作為緩沖溶液，100 mmol/L(10 μL)過氧化氫作為電子供體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CRP的光電檢測(cè)。原理如圖1所示。

2.2 材料的表征

2.2.1PAF的合成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合成產(chǎn)物在750 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)因?qū)ξ蝗〈江h(huán)而產(chǎn)生的峰，與文獻(xiàn)[1]一致；其透射電鏡圖和X射線粉末衍射(XRD)圖也與文獻(xiàn)[1]基本吻合，表明本實(shí)驗(yàn)成功合成了PAF。

2.2.2AuNPs@PAF的微觀形貌取適量的Au NPs@PAF制樣后置于透射電子顯微鏡下觀察，結(jié)果(圖2)顯示，Au NPs已成功負(fù)載在透明薄片狀的PAF上，且顆粒分布均勻。

2.3 不同材料修飾的ITO玻璃片的光電化學(xué)響應(yīng)

實(shí)驗(yàn)考察了不同材料修飾的ITO玻璃片的光電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。裸ITO玻璃片的光電響應(yīng)電流很小(曲線a)；卟啉單體修飾的ITO玻璃片的光電流響應(yīng)在裸ITO玻璃片的基礎(chǔ)上略有增加(曲線b)；PAF修飾的ITO玻璃片的光電響應(yīng)電流比卟啉單體修飾的又有所增加(曲線c)，說明PAF的光電響應(yīng)比卟啉單體大；Au NPs@PAF修飾的ITO玻璃片的電流響應(yīng)(曲線d)相對(duì)曲線c明顯增加，這是因?yàn)榻鸺{米顆粒催化PAF，使其有較強(qiáng)的光電響應(yīng)。

2.4 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

圖4 不同修飾電極界面的交流阻抗行為Fig.4 Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) by using different modified electrodesa.bare GCE;b.PAF/CHIT/GCE;c.Au NPs@PAF/CHIT/GCE; d.anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;e.BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;f.CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/GCE;0.1-10 000 Hz

圖5 不同修飾的ITO玻璃片在含有100 mmol/L過氧化氫 的PBS緩沖溶液中的I～t響應(yīng)曲線Fig.5 I-t response curve of different modified ITOs in phosphate buffer solution containing 100mmol/L H2O2a.bare ITO;b.PAF/CHIT/ITO;c.Au NPs@PAF/CHIT/ITO; d.anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO;e.BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO;f.CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT/ITO

實(shí)驗(yàn)利用玻碳電極，通過交流阻抗表征了傳感器界面的層層修飾過程，圖4是玻碳電極層層修飾過程中各界面在含有5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6及0.1 mol/L KCl溶液中的交流阻抗譜。裸電極的阻抗曲線近似一條直線(曲線a)，說明裸玻碳電極對(duì)電子傳遞幾乎沒有阻礙;PAF/CHIT修飾的玻碳電極的阻抗值比裸的ITO玻璃片略微增大(Ret=250 Ω，曲線b)，說明PAF/CHIT對(duì)電子傳遞有一定的阻力；Au NPs@PAF/CHIT 修飾的玻碳電極的阻抗值比曲線b略大(Ret=750 Ω，曲線c)，說明金納米顆粒成功修飾在PAF上;anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修飾的玻碳電極的阻抗值比曲線c明顯增大(Ret=1 100 Ω，曲線d)，說明anti-CRP阻礙了[Fe(CN)]64-/3-傳遞電子，表明anti-CRP已經(jīng)固定在玻碳電極上；BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修飾的玻碳電極的阻抗值比曲線d增大(Ret=1 750 Ω，曲線e)，說明BSA充分封閉了非特異性結(jié)合位點(diǎn);CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF/CHIT修飾的玻碳電極的阻抗值在曲線e的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增大(Ret=2 500 Ω，曲線f)，表明CRP與anti-CRP特異性結(jié)合成功，形成不導(dǎo)電的免疫復(fù)合物，從而使阻抗增大。

2.5 不同修飾ITO玻璃片的光電化學(xué)特性

采用計(jì)時(shí)電流法表征ITO玻璃片的層層修飾過程，結(jié)果如圖5所示。裸ITO的光電響應(yīng)曲線對(duì)光響應(yīng)很小(曲線a)。由于PAF自身具有較強(qiáng)的光電響應(yīng)，使得PAF/CHIT修飾的ITO玻璃片對(duì)光的響應(yīng)電流值明顯增大(曲線b);由于金納米顆粒對(duì)PAF的催化作用，使Au NPs@PAF/CHIT修飾的ITO玻璃片的電流在曲線b的基礎(chǔ)上明顯增大(曲線c)，表明金納米顆粒與PAF成功結(jié)合并對(duì)電流有協(xié)同增強(qiáng)作用；由于抗體對(duì)電子傳遞有阻礙作用,anti-CRP修飾Au NPs@PAF/CHIT的ITO玻璃片的電流值相較于曲線c明顯減小(曲線d)，說明anti-CRP與Au NPs@PAF結(jié)合成功;經(jīng)BSA封閉后，anti-CRP修飾的Au NPs@PAF/CHIT/ITO玻璃片的光電流響應(yīng)值有略微減小，證明BSA充分封閉了非特異性結(jié)合位點(diǎn)(曲線e)；結(jié)合了CRP抗原后的BSA/anti-CRP/Au NPs@PAF-CHIT/ITO玻璃片的電流響應(yīng)明顯減小，說明CRP抗原與anti-CRP進(jìn)行了充分結(jié)合。綜合上述過程，本實(shí)驗(yàn)原理得到驗(yàn)證。

2.6 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.6.1PAF質(zhì)量濃度對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響實(shí)驗(yàn)考察了不同質(zhì)量濃度的PAF對(duì)光電響應(yīng)電流的影響。結(jié)果顯示，PAF從0.5 mg/mL增至2 mg/mL時(shí)，電流響應(yīng)值隨之增大，并在2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)繼續(xù)增加PAF質(zhì)量濃度時(shí)，響應(yīng)電流隨PAF質(zhì)量濃度的增大而減小。因此，選擇2 mg/mL作為PAF的最佳質(zhì)量濃度。

2.6.2過氧化氫濃度對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響H2O2作為供電子基，在檢測(cè)體系中起傳遞電子的作用，從而影響電流值。本實(shí)驗(yàn)選取不同濃度(1、5、20、50、100、300、500 mmol/L)過氧化氫作為供電子基測(cè)量免疫傳感器的響應(yīng)電流值。結(jié)果顯示，電流值隨H2O2濃度的增大逐漸增大，當(dāng)H2O2濃度達(dá)100 mmol/L時(shí)，電流值達(dá)到最大，隨后趨于平緩，因此選擇100 mmol/L作為測(cè)量基底中H2O2的濃度。

2.6.3測(cè)量電勢(shì)對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響電勢(shì)的大小直接影響電信號(hào)的大小，本實(shí)驗(yàn)對(duì)光電免疫傳感器的測(cè)量電勢(shì)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)測(cè)量電勢(shì)從100 mV升至700 mV時(shí)，CRP的電流響應(yīng)值與空白電流響應(yīng)值的比值逐漸增大，當(dāng)測(cè)量電勢(shì)繼續(xù)升至1 200 mV時(shí)，兩者的比值逐漸減小。因此選擇700 mV作為該光電免疫傳感器的的最佳測(cè)量電勢(shì)。

2.6.4CRP抗體培育時(shí)間對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響溫度的高低直接影響抗原與抗體結(jié)合的穩(wěn)定程度。為了考察CRP抗體培育時(shí)間對(duì)響應(yīng)電流的影響，本實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間(15、30、40、60、75、90 min)下培育CRP抗體。結(jié)果表明，響應(yīng)電流值隨抗體培育時(shí)間的增加而減小，并于60 min時(shí)達(dá)到最低值，此后電流值隨培育時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸趨于穩(wěn)定，由于本免疫傳感器為信號(hào)減小型，所以選擇60 min 作為抗體的培育時(shí)間。

2.6.5CRP抗體質(zhì)量濃度對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響實(shí)驗(yàn)考察了不同CRP抗體質(zhì)量濃度(0.5、5、10、30、50、80、100 μg/mL)對(duì)響應(yīng)電流的影響。結(jié)果表明，隨著CRP抗體質(zhì)量濃度的增加，電流值逐漸減小，當(dāng)抗體質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)電流值最低，此后繼續(xù)增加CRP抗體質(zhì)量濃度，傳感器的響應(yīng)電流值逐漸趨于穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇50 μg/mL作為該光電免疫傳感器的最佳CRP抗體質(zhì)量濃度。

2.6.6CRP培育時(shí)間對(duì)光電響應(yīng)電流值的影響為了讓CRP抗體與CRP抗原達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)合狀態(tài)，從而得到最佳的響應(yīng)電流，對(duì)CRP抗原培育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。固定50 μg/mL抗體和50 ng/mL抗原，改變抗原培育時(shí)間。結(jié)果表明，當(dāng)培育時(shí)間在10～60 min 時(shí)，電流值隨培育時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，60 min時(shí)電流達(dá)到最佳，此后電流響應(yīng)值逐漸趨于穩(wěn)定，所以選擇60 min作為該光電免疫傳感器的最佳CRP培育時(shí)間。

圖6 CRP光電化學(xué)免疫傳感器的選擇性Fig.6 Selective of the CRP photoelectrochemical immunosensorA:photoelectric response current of CRP comparing with that of different interfering substances,B:photoelectric response current of CRP mixed with different interference substances

2.7 傳感器的校準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，培育不同濃度的CRP，檢測(cè)光電免疫傳感器的響應(yīng)電流值。結(jié)果顯示，CRP的質(zhì)量濃度(C)在0.05 ～60 ng/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)電流(I)呈較好的線性關(guān)系，線性方程為I=-1.987C+169.81，相關(guān)系數(shù)r2=0.994 6。以3SD/k計(jì)算出檢出限為0.017 ng/mL。

2.8 光電免疫傳感器的選擇性

實(shí)驗(yàn)選擇500 ng/mL人絨毛促性腺激素(HCG)、前列腺特異抗原(PSA)和1%的牛血清蛋白(BSA)為干擾物質(zhì)，與空白溶液和50 ng/mL CRP溶液的響應(yīng)電流進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖6A所示，干擾物的響應(yīng)電流與空白溶液的響應(yīng)電流相差不大，但50 ng/mL CRP溶液的響應(yīng)電流相比空白溶液有明顯變化，說明HCG、PSA和BSA基本不造成干擾，此光電免疫傳感器對(duì)CRP有較好的選擇性。

將1 000 ng/mL丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、葡萄糖(G)作為干擾物質(zhì)，分別與50 ng/mL的CRP等體積混合，并與50 ng/mL CRP溶液的電流響應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖6B所示，混合溶液的響應(yīng)電流與CRP溶液相差不大，說明Ala、Glu、Gly和G對(duì)此光電免疫傳感器的干擾很小。

2.9 光電免疫傳感器的回收率測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在稀釋過的血清樣品中加入低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的CRP進(jìn)行回收率測(cè)定。每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次。結(jié)果如表1所示，其平均回收率為102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～3.0%，結(jié)果令人滿意，說明該傳感器可用于血清中CRP的檢測(cè)。

表1 真實(shí)血樣中CRP回收率的測(cè)定Table 1 Recovery of CRP in real human serum

2.10 與其它CRP檢測(cè)方法的對(duì)比

對(duì)比CRP的其它檢測(cè)方法 (表2)，本文所制的傳感器具有較低的檢出限。并且由于該傳感器無需標(biāo)記，故其制備簡(jiǎn)單，使用方便省時(shí)。

表2 幾種CRP檢測(cè)方法的對(duì)比Table 2 Comparison of several detection methods of CRP

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以間-四苯基卟吩合成了具有優(yōu)良光電響應(yīng)特性的卟啉多孔化合物PAF，并將其與金納米顆粒摻雜在一起的混合物作為固定基質(zhì)將C-反應(yīng)蛋白抗體固定在ITO玻璃片上，在此基礎(chǔ)上滴加C-反應(yīng)蛋白進(jìn)行培育，形成免疫復(fù)合物。該免疫復(fù)合物可阻礙電子傳遞，導(dǎo)致光電流響應(yīng)減小，電流減小的程度與CRP的濃度成反比，從而制得無標(biāo)記型的CRP光電傳感器。該傳感器制備簡(jiǎn)單，使用方便省時(shí)。