林春梅，劉瑩峰，張子豪，李全忠，李 丹，翟翠萍，肖 前，鄭建國

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623)

我國的DOPO工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用已逐漸成熟，但DOPO的生理毒性與環(huán)境毒性尚無相關(guān)報(bào)道。因DOPO含有活性親核基團(tuán)，且在環(huán)境中有一定的持久性，攝入人體后可能產(chǎn)生生物蓄積，對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生安全隱患；其未反應(yīng)的單體可長期儲(chǔ)存在塑料聚合物中，且可作為親核試劑遷移到食品浸泡液，繼而進(jìn)入人體后可能會(huì)與某些羰基化合物發(fā)生反應(yīng)，影響人體正常的生理活動(dòng)。因此，建立塑料聚合物中DOPO遷移量的檢測(cè)方法至關(guān)重要。而塑料產(chǎn)品中DOPO遷移量的分析方法尚未見報(bào)道，目前關(guān)于DOPO含量的檢測(cè)方法為氣相色譜法[12]。本文建立了測(cè)定塑料聚合物中DOPO遷移量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，該法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，可用于塑料聚合物中DOPO遷移量的分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜-質(zhì)譜儀，配G1312B二元混合泵；Agilent 6410型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)和MassHunter軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國安捷倫公司)；IKAMS2 Minishaker型渦旋振蕩器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

DOPO(99.0%，德國Dr.E公司)；甲醇、乙腈(美國Tedia公司)，所有試劑均為色譜純；精制橄欖油；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 工作溶液的配制

稱取DOPO標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的DOPO儲(chǔ)備液。移取以上儲(chǔ)備液100 μL置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的DOPO標(biāo)準(zhǔn)中間液。

水基食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取DOPO標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用水基食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇)定容，得到相應(yīng)介質(zhì)中DOPO質(zhì)量濃度分別為 0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

橄欖油標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取4.0 g橄欖油于8個(gè)試管中，向其中加入DOPO標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100 ng/g 的DOPO標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在以上8個(gè)試管中加入4.0 mL含38%甲醇的乙腈溶液，旋渦混合器混勻5 min后靜置分層，用注射器吸取上層萃取溶液，經(jīng)過濾后待測(cè)定。

1.3 樣品處理

遷移量測(cè)試樣品按照(EU)2017/752的要求[13]，每6 dm2食品接觸材料用1 L食品模擬液進(jìn)行浸泡。

對(duì)于水基模擬物(3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇)：取浸泡液，用0.22 μm針式過濾器過濾后進(jìn)行分析。

對(duì)于橄欖油模擬物：取4 mL橄欖油浸泡液于離心管中，加入4 mL含38%甲醇的乙腈溶液，渦旋振蕩5 min，靜置分層后，取上層萃取液用0.22 μm針式過濾器過濾后進(jìn)行分析。

為減少背景干擾，制備空白食品模擬液(空白橄欖油模擬液為經(jīng)萃取后的含38%甲醇的乙腈萃取液)，經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾后進(jìn)行分析。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：A為2 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫：40 ℃；洗脫程序：0～4 min，95%B；4～5 min，95%～100% B；5～6 min，100%～95%B；流速：0.6 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正離子模式；干燥氣溫度：350 ℃；氣體流速：10 L/min；霧化氣壓力:0.34 MPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；碰撞能量：1～51 eV；駐留時(shí)間：50 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

DOPO具有熱穩(wěn)定性，屬于半揮發(fā)性有機(jī)化合物,且能溶于甲醇、乙醇和乙腈等極性有機(jī)溶劑中，所以其均能在氣相色譜-質(zhì)譜與液相色譜-質(zhì)譜中被檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣相色譜選取常規(guī)中等極性的色譜柱，液相色譜選取常規(guī)C18色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，均能使DOPO出峰。考慮到樣品以水基模擬浸泡液為主，DOPO在液相環(huán)境中更易被離子化，且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明DOPO的測(cè)定在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中比氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能得到更低的檢出限和定量下限。因此，本研究最終選用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，ZORBAX SB-C18色譜柱分離。

將1.0 μg/mL的DOPO標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明DOPO在正離子模式下的最強(qiáng)峰為[M+NH4]+，其次為分子離子峰[M+H]+；負(fù)離子模式下的最強(qiáng)峰為[M-H+NH4]-，其次為分子離子峰[M-H]-。其中在正離子模式下，離子峰[M+NH4]+響應(yīng)最好且易于形成碎片離子，所以對(duì)該離子進(jìn)行子離子掃描，得到碎片離子信息[M+H]+(m/z=217),[M-OH]+(m/z=199),[M-C5H4]+(m/z=152)。為得到較好的靈敏度，分別對(duì)定性定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定DOPO的母離子為[M+NH4]+(m/z=234)，子離子為m/z217、199、152，碎裂電壓均為135 V，碰撞能量分別為20、20、45 eV。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及DOPO的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Box-Behnken central composite design and the results of DOPO recovery experiments

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-2 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸)、甲醇-0.1%氨水溶液、乙腈-水作為流動(dòng)相，對(duì)質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的DOPO標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)由于體系中缺少質(zhì)子，導(dǎo)致目標(biāo)化合物的響應(yīng)較差。而甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-2 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸)兩種流動(dòng)相有利于ESI正模式離子的生成，甲醇-0.1%氨水溶液有利于ESI負(fù)模式離子的生成。由于DOPO在ESI正模式下易形成[M+NH4]+和[M+H]+離子，且目標(biāo)物響應(yīng)最大，因此選擇甲醇-2 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作流動(dòng)相更有利于目標(biāo)物離子的生成。

2.3 橄欖油浸泡液中萃取溶劑的選擇

分別采用乙醇、甲醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液、25%乙腈甲醇溶液、50%乙腈甲醇溶液、75%乙腈甲醇溶液7種溶劑對(duì)橄欖油浸泡液中的DOPO進(jìn)行萃取試驗(yàn)。結(jié)果表明，乙醇、甲醇因含氫鍵而與橄欖油混合后易乳化，導(dǎo)致與橄欖油分層不明顯；50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液兩種萃取溶劑的回收率均較低，可能由于DOPO在水中的溶解度較低所致；而用乙腈甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取時(shí)，回收率均較高，且與橄欖油分層清晰。因此選擇乙腈甲醇混合溶劑進(jìn)行萃取，并采用響應(yīng)面模型[14-15]對(duì)萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化。以混合溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)(A,%)、萃取溶劑體積(B,mL)、渦旋時(shí)間(C,min)作為變量，每一變量設(shè)置3個(gè)水平，以含0.1 mg/kg DOPO的10 g橄欖油浸泡液經(jīng)萃取后的回收率為響應(yīng)值，根據(jù) Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平共17次實(shí)驗(yàn)，回收率見表1。得到回歸模型方程：Recovery=77.57+8.84A+2.40B+2.69C+3.76A2-1.89C2。

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表2可知該模型的F值為11.65，概率p值為0.001 9<0.05，說明各影響因子對(duì)DOPO回收率的影響顯著。綜合試驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整確定系數(shù)為0.987 4，說明模型的擬合程度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值間的相關(guān)性較好，能解析模型98.74%的響應(yīng)值變化,可用此模型對(duì)橄欖油中DOPO的遷移量進(jìn)行分析。由F值可知，該模型的一次項(xiàng)A影響極顯著，B、C影響不顯著。單因素對(duì)回收率的影響順序?yàn)锳>B>C，即混合溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)>萃取溶劑體積>渦旋時(shí)間。二次項(xiàng)C2、B2影響顯著，A2影響不顯著，根據(jù)響應(yīng)面交互作用對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行兩兩交互作用(見圖1)。經(jīng)響應(yīng)面模型分析得出最佳參數(shù)為：甲醇含量為38%，萃取溶劑體積為4 mL，渦旋時(shí)間為5 min，此時(shí)萃取回收率理論值為91.9%。采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行DOPO的萃取回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，得到平均回收率為91.2%，與理論值相當(dāng)，所以最終采用38%甲醇的乙腈溶液為萃取溶劑，萃取體積為4 mL，萃取時(shí)間為5 min。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance results for Box-Behnken central composite design

*no data

圖1 三因素交互影響的DOPO回收率響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface 3D plots for the recoveries of DOPO

2.4 方法的線性關(guān)系與定量下限

采用以上方法對(duì)DOPO標(biāo)準(zhǔn)工作溶液采用MRM模式進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標(biāo)，DOPO的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由表3可知，4種模擬浸泡液中DOPO在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 4～0.999 4。以10倍信噪比(S/N=10)作為定量下限(LOQ)，對(duì)實(shí)際樣品模擬液進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，得到DOPO在3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇和橄欖油浸泡液中的LOQ分別為0.10、0.09、0.07 ng/mL和0.85 ng/g。綜合考慮，將水基模擬液中DOPO的LOQ設(shè)為0.10 ng/mL，橄欖油模擬液中的LOQ設(shè)為1.0 ng/g(見表3)。

表3 DOPO在4種模擬浸泡液中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量下限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Regression equations,correlation coefficients,limits of quantitation,recoveries and RSDs of DOPO in four simulated solutions

2.5 方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別在3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇和橄欖油空白基質(zhì)的模擬物中對(duì)DOPO進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。添加3個(gè)不同濃度水平的DOPO標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到最終質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0、5.0 ng/mL的基質(zhì)加標(biāo)溶液，每個(gè)添加水平平行測(cè)試6次(見表3)。結(jié)果表明：DOPO在4種模擬物中的加標(biāo)回收率為85.3%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于7.3%，方法的精密度和準(zhǔn)確度均滿足定量分析要求。

2.6 DOPO在模擬浸泡液的遷移規(guī)律及實(shí)際樣品測(cè)試

分別選取聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、丙烯腈-苯乙烯共聚物(AS)、聚碳酸酯(PC)、聚酰胺(PA)、聚碳酸酯和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(PC/ABS)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBT)8種塑料樣品，每種塑料材質(zhì)選取大小形狀和表面積基本一致的樣品按照(EU)2017/752進(jìn)行食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇、橄欖油)浸泡實(shí)驗(yàn)，分別放置在室溫(25 ℃)、40 ℃、70 ℃和90 ℃的恒溫水浴鍋中，放置時(shí)間分別為1、5、10、15、20、30 d，檢測(cè)模擬浸泡液中DOPO的遷移量。結(jié)果表明，PE、PP和AS塑料樣品中均未檢出DOPO，PET、PBT樣品中檢出微量的DOPO(0.1～1.0 ng/mL)；PC、PA、PC/ABS樣品中均檢出DOPO，這可能是由于DOPO作為反應(yīng)型阻燃劑被加至PC、PA和PC/ABS塑料聚合物中，生成酯類阻燃劑時(shí)殘留了DOPO單體。其中，PC樣品在10%乙醇和50%乙醇中40 ℃下浸泡5 d即檢出DOPO，質(zhì)量濃度分別為1.2、1.7 ng/mL；PA、PC/ABS樣品在50%乙醇中70 ℃下浸泡5 d即檢出DOPO，質(zhì)量濃度分別為1.1、2.5 ng/mL。由于DOPO易溶于極性有機(jī)溶劑，所以在3%乙酸和非極性的橄欖油模擬物中，PC、PA和PC/ABS樣品均未檢出DOPO，僅在70 ℃浸泡達(dá)15 d時(shí)，PC、PC/ABS樣品在3%乙酸中有少量檢出。DOPO在上述模擬物中的遷移量規(guī)律為：醇類模擬液>酸性模擬液>油脂類模擬液。

圖2 5種材質(zhì)在50%乙醇模擬物中DOPO的遷移量 Fig.2 Migration of DOPO from 5 materials in 50% ethanol simulant

PBT、PET、PA、PC/ABS、PC 5種塑料樣品在50%乙醇中DOPO的遷移量見圖2。由圖2可知，DOPO的遷移量受溫度與時(shí)間的影響較大，在相同時(shí)間下，PA、PC/ABS、PC中的DOPO遷移量隨著溫度的升高而增大，其中PC樣品在90 ℃時(shí)的遷移量約為40 ℃時(shí)的2.7倍，PC/ABS樣品在90 ℃時(shí)的遷移量約為40 ℃時(shí)的2.1倍，PA樣品在90 ℃時(shí)的遷移量約為40 ℃時(shí)的1.8倍。當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，遷移時(shí)間在5～15 d范圍內(nèi)，隨著遷移時(shí)間的增加，PA、PC/ABS和PC中DOPO遷移量的平均增幅分別為131%、56.5%和52.4%；而在15～30 d范圍內(nèi)，遷移量的增幅逐步減弱，PA、PC/ABS和PC中DOPO遷移量的平均增幅分別為30.2%、31.5%和23.2%。以上3種塑料樣品在溫度70 ℃，浸泡時(shí)間15 d條件下，DOPO的遷移量基本達(dá)到飽和。表明PA、PC、PC/ABS塑料在盛裝非醇類液體，低溫或常溫且短時(shí)間保存時(shí)相對(duì)安全。

3 結(jié) 論

本文建立了測(cè)定不同塑料聚合物材料中DOPO遷移量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，水基浸泡液直接進(jìn)樣測(cè)定，橄欖油浸泡液通過萃取后進(jìn)行測(cè)定，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了橄欖油浸泡液中DOPO的提取條件。對(duì)不同材質(zhì)塑料聚合物中DOPO遷移量的研究表明，遷移溫度和遷移時(shí)間是影響DOPO遷移量的主要因素。水基模擬物(3%乙酸、10%乙醇、50%乙醇)和橄欖油模擬物中DOPO的定量下限分別為0.1 ng/mL和1.0 ng/g；樣品加標(biāo)回收率為85.3%～110%，RSD不大于7.3%。該方法靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度好，可為塑料聚合物或復(fù)合塑料聚合物中DOPO的遷移規(guī)律研究提供支持。