李蕾，陳平，潘燕，柴琳琳，陳海濤，蘭建云△

鹽城市第一人民醫(yī)院 1轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，2腫瘤科，3病理科(江蘇鹽城 224000)

PD-L1是T淋巴細(xì)胞表面誘導(dǎo)表達(dá)的抑制性受體程序性死亡因子-1(programmed death 1，PD-1)的配體分子[1]。PD-L1的主要功能是調(diào)控機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，反應(yīng)機(jī)制通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞結(jié)合 PD-1，向T細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)，對(duì)外周T細(xì)胞的免疫耐受進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]。PD-L1靶向藥物被期望用于乳腺癌患者的臨床治療。針對(duì)腫瘤的多種靶向藥物目前已大量應(yīng)用于臨床，以程序性死亡配體1(programmed death ligand-1，PD-L1)為靶點(diǎn)的Tecentriq(Atezolizumab)、Bavenci(Avelumab)等單克隆抗體藥物已獲批上市，而在乳腺癌患者的臨床實(shí)驗(yàn)中，靶向藥物的療效和不良反應(yīng)仍需要制定嚴(yán)格的評(píng)估體系。本研究使用免疫組化法檢測(cè)80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中PD-L1表達(dá)，研究其與患者臨床病理特征以及乳腺癌組織內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TILs)各亞型表達(dá)的相關(guān)性。TILs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成直接參與體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤局部免疫應(yīng)答[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)同樣接受新輔助化療，TILs表達(dá)高與表達(dá)低的乳腺癌患者相比，病理完全緩解的概率增高，表明患者對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)程度能夠影響化療的療效[4-6]。由此我們推測(cè)，TILs表達(dá)高低與乳腺癌患者的靶向藥物療效相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)乳腺癌中PD-L1的研究主要在其表達(dá)量與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，本研究首次提出建立TILs與PD-L1表達(dá)量之間的關(guān)系，旨在為乳腺癌PD-L1靶向藥治療的藥療效及預(yù)后建立標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)估系統(tǒng)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鹽城市第一人民醫(yī)院2014年9月至2016年9月資料完整的術(shù)前未經(jīng)治療的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理標(biāo)本80例，年齡38～78歲，中位年齡51歲。

1.2 主要試劑 山羊抗人PD-L1一抗購自Abcam公司，抗體稀釋濃度為1∶200。CD8、CD4、CD3、CD20、CD68、FOXP3一抗購自Dako公司，CD8、CD4、CD3、CD20、CD68、FOXP3抗體不稀釋，直接使用；FOXP3抗體稀釋1∶100。鼠免聚合物二抗試劑盒、DAB顯色液試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟包埋組織后進(jìn)行4 μm常規(guī)切片，脫蠟、復(fù)水后抗原修復(fù)：豎直將玻片插入專用塑料匣，加滿新鮮配制的抗原修復(fù)液，將塑料匣放入微波爐，中溫20 min，拿出靜置約1 h。按dH2O，5 min，3次；3%H2O2，10 min；dH2O，5 min，2次；TBST，5 min處理玻片。吸水紙擦去玻片上多余液體，免疫組化筆圈取組織片，覆蓋全組織片范圍滴加封閉液，將玻片移入濕盒中，室溫1 h封閉。上一抗：紙巾吸除封閉液，滴加一抗溶液，一個(gè)組織片20 μL。作為陰性對(duì)照，將同一張玻片上保留1個(gè)組織片的封閉液。4℃，濕盒，過夜。取出玻片，PBS洗3次，5 min/次組織上滴加二抗溶液，室溫15 min，組織上滴加新鮮配制的DAB溶液，3～5 min顯色，將玻片浸入dH2O終止顯色后蘇木精復(fù)染，1 min，后續(xù)同HE染色，除去伊紅染色步驟。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)不著色或著色率<20%判斷為陰性表達(dá)，著色率>20%判斷為陽性表達(dá)。PD-L1染色顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色，清晰的棕黃色顆粒判斷為陽性。CD8、CD4、CD3、CD20、CD68、FOXP3：光鏡下染色棕黃色為陽性；CD8、CD4、CD3、CD20、CD68為胞膜著色，F(xiàn)OXP3為胞核著色。

1.4 FISH 采用PathVysion探針試劑盒(購自美國(guó)雅培公司)進(jìn)行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶Her2基因狀態(tài)檢測(cè)。流程簡(jiǎn)述如下：常規(guī)烤片、脫蠟后，將待檢測(cè)的切片置于ThermoBrite Elite自動(dòng)FISH制片機(jī)(購自德國(guó)徠卡公司)內(nèi)，依次進(jìn)行預(yù)處理、加探針、封蓋片、雜交以及雜交后的洗脫。切片經(jīng)DAPI對(duì)比染色細(xì)胞核。在Ariol-DM6000全自動(dòng)顯微圖像掃描分析系統(tǒng)(購白德國(guó)徠卡公司)中觀察并分析結(jié)果。FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)依照乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2014版)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用2檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)資料比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特點(diǎn) 選取的80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者均為女性。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過放、化療或者其他抗腫瘤藥物的治療。乳腺癌患者根據(jù)第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期。TNM分期統(tǒng)計(jì)：T1期24例，T2期39例，T3期12例，T4期5例。N分期：N0期57例，N1期7例，N2期11例，N3期5例。80例腫瘤組織中，PD-L1陽性率為35.22%(31/80),見圖1。PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)按2檢驗(yàn)后的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：年齡按中位年齡區(qū)分后計(jì)數(shù)與PD-L1陽性表達(dá)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同腫瘤的大小、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分別與PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)相比較，結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FISH檢測(cè)Her2陽性率與PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的Lumina分型與PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)(P<0.05)。見表1。

A：乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤組織中PD-L1呈陰性表達(dá)；B:PD-L1著色率<20%的弱陽性表達(dá)；C：PD-L1著色率>20%的陽性表達(dá);D:PD-L1著色率>50%的陽性表達(dá)

圖1乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)情況(En Vision兩步法，×200)

2.2 免疫組化結(jié)果分析 TILs標(biāo)記抗體CD4、CD20、CD68陽性表達(dá)數(shù)越高，PD-L1的表達(dá)陽性率越高(P<0.05)。FOXP3、CD8、CD3與PD-L1陽性表達(dá)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 乳腺癌患者PD-L1蛋白表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 例

表2 乳腺癌患者與TILs各亞型表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

本研究通過統(tǒng)計(jì)80例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)乳腺癌CD4、CD20、CD68陽性表達(dá)數(shù)越高，PD-L1的表達(dá)陽性數(shù)越高(P<0.05)。FISH檢測(cè)Her2陽性表達(dá)數(shù)結(jié)果與PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即Her2陽性表達(dá)數(shù)越高，PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)越高。對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的Lumina分型統(tǒng)計(jì)數(shù)目與PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)進(jìn)行分析，三陰性乳腺癌的腫瘤組織與其他類型的腫瘤組織相比，PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)低(P<0.05)。

PD1與其配體PD-L相互作用，向T細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)，構(gòu)成腫瘤微環(huán)境，在腫瘤中形成免疫抑制?？筆D-L1的人源化單克隆抗體—Atezolizumab(MPDL3280A、MEDI4736或BMS-936559)，能夠擾亂PD-L1和PD1的相互作用，恢復(fù)T細(xì)胞功能[7-8]。Atezolizumab已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌(mUC)，目前已被應(yīng)用于三陰性乳腺癌的臨床治療實(shí)驗(yàn)。在平均40周的用藥隨訪期間，測(cè)試54例三陰性乳腺癌患者的藥物安全性，其中37例(69%)患者PD-L1陽性表達(dá)。24%的患者客觀緩解十分明顯，獲得完全緩解的人數(shù)為10%，部分緩解的人數(shù)為14%。無進(jìn)展生存期24周的患者比例為29%。隨訪期最后表現(xiàn)出貧血和中性粒細(xì)胞減少等嚴(yán)重的不良反應(yīng)的患者有6例(11%)，36例(67%)患者發(fā)生了如疲勞、惡心、發(fā)熱等藥物相關(guān)性不良反應(yīng)[9-10]。因此，PD-L1靶向藥物在臨床使用前后以及療效的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)仍待建立。

TILs包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在聚集后，通過刺激PD-1/PD-L1途徑逃脫免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺癌CD4、CD20、CD68陽性表達(dá)數(shù)越高，PD-L1的表達(dá)陽性數(shù)越高(P<0.05)。結(jié)果反映在不同類型的腫瘤組織中，TILs中CD3+TILs、CD4+TILs、CD8+TILs、CD20+TILs、CD68+TILs、FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)等亞型的數(shù)目和比例是不同的。TILs數(shù)目與腫瘤患者的生存時(shí)間被證實(shí)顯著相關(guān)?；熁蚩笻ER-2靶向治療后，TILs比例較高的患者與比例低的患者相比，有更長(zhǎng)的無病生存期及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期[11-14]。腫瘤患者在接受化療藥物治療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放出腫瘤相關(guān)抗原，從而觸發(fā)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)[15-16]。腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)在TILs比例較高的腫瘤內(nèi)表現(xiàn)得更強(qiáng)烈，腫瘤細(xì)胞的壞死更為明顯，病理完全緩解的概率也更高。本研究中CD4、CD20、CD68陽性表達(dá)數(shù)與PD-L1的表達(dá)陽性數(shù)表達(dá)相關(guān)。在腫瘤患者中已發(fā)現(xiàn)自發(fā)的CD4+TILs細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的反應(yīng)，腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+TILs細(xì)胞密度高的患者幾乎所有腫瘤類型預(yù)后良好[12]。有研究顯示，向機(jī)體回輸CD4+T細(xì)胞型細(xì)胞因子，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)CD4+TILs的抗腫瘤作用，使CD4+TILs細(xì)胞廣泛應(yīng)用在腫瘤治療中。CD68是一種分子作為標(biāo)記檢測(cè)人體組織中的巨噬細(xì)胞，腫瘤組織中腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與血管新生、癌浸潤(rùn)深度、病理分期和患者的預(yù)后明顯相關(guān)[12,17]。而且腫瘤浸潤(rùn)的CD20+TILs與患者的預(yù)后密切相關(guān)。目前研究結(jié)果支持，不論是腫瘤細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，PD-L1表達(dá)陽性率越高，PD-1/PD-L1抑制劑有效率越高[18-19]。我們推測(cè)，在高TILs比例的患者使用PD-L1靶向藥物后，療效要高于低TILs比例者。

免疫治療在多臨床研究中心證實(shí)其在腫瘤藥物試驗(yàn)中療效顯著。較其他惡性腫瘤，部分乳腺癌患者的生存時(shí)間更長(zhǎng)，這是由于乳腺癌細(xì)胞較其他癌細(xì)胞對(duì)放化療等更敏感。其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌和三陰性乳腺癌在現(xiàn)有治療方法下療效較差。PD-L1靶向藥物可能在未來使這一部分患者受益，生存期延長(zhǎng)。本研究以乳腺癌組織PD-L1蛋白的表達(dá)情況為切入點(diǎn),探討其與患者臨床病理特征以及TILs中各種亞型的表達(dá)量的關(guān)聯(lián)。通過我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PD-L1的表達(dá)與乳腺癌更差的臨床病理特征密切相關(guān)。同時(shí)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)量與TILs中各種亞型的表達(dá)量相關(guān)，同時(shí)與乳腺癌的Lumina分型相關(guān)。TILs各種亞型的表達(dá)量與比例不同，被證實(shí)與化療等乳腺傳統(tǒng)治療臨床療效相關(guān)，國(guó)際上已經(jīng)開始組建TILs工作小組建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)化的乳腺癌患者TILs的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估體系。本研究希望可以通過判斷TILs的比例，在未來的臨床研究中，觀察患者靶向藥使用后療效，建立PD-L1靶向藥作用的可靠預(yù)測(cè)指標(biāo)。乳腺癌患者分析TILs數(shù)量比例后，通過人為干預(yù)治療，比如放療、化療或者疫苗治療等多種技術(shù)手段，改變TILs的比例，最終增強(qiáng)患者免疫調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)PD-L1靶向藥物的療效，使其生存獲益。