陳攀麗 唐建榮 付雪芹

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)發(fā)病率可達(dá)283～493萬人左右[1]，臨床上ALD的發(fā)生能夠?qū)е禄颊叨嗥鞴俟δ芩ソ叩陌l(fā)生，增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。PNPLA3基因位點(diǎn)rs738409多態(tài)性的改變能夠通過對于局部肝臟上皮細(xì)胞微環(huán)境的改變，誘導(dǎo)趨化因子和補(bǔ)體成分的激活，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟小葉結(jié)構(gòu)的損傷。PNPLA3基因位點(diǎn)多態(tài)性還能夠通過增加肝臟上皮細(xì)胞對于酒精的代謝障礙，導(dǎo)致酒精的蓄積效應(yīng)明顯增強(qiáng)，加劇了酒精對于肝臟上皮細(xì)胞的損傷[3]。部分研究者探討了PNPLA3基因多態(tài)性與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)系，認(rèn)為PNPLA3基因多態(tài)性能夠?qū)е履[瘤易感性的明顯上升，同時(shí)還能夠降低腫瘤放化療治療的敏感性[4-5]，但關(guān)于PNPLA3基因多態(tài)性與ALD的關(guān)系研究不足。本研究選取2016年1月至2018年2月在我院治療的ALD患者140例，探討了PNPLA3基因位點(diǎn)rs738409多態(tài)性與ALD的關(guān)系，報(bào)道如下。

資料和方法

一、一般資料

選取2016年1月至2018年2月在我院治療的ALD患者140例(ALD組)，同時(shí)選取嗜酒者但未診斷ALD志愿者100例(嗜酒組)和不飲酒健康志愿者100例(對照組)作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合《酒精性肝病診療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)；(2)嗜酒組符合：有強(qiáng)烈的飲酒渴求、發(fā)作時(shí)間固定，不飲酒時(shí)出現(xiàn)生理和心理癥狀，同時(shí)B超、肝功能等檢查無異常；(3)患者及家屬對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有病毒性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病等；(2)合并有惡性腫瘤，心、肺等重要臟器功能不全等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

PNPLA3基因多態(tài)性的檢測：取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行分離，每1 mL TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2 mL氯仿，進(jìn)行裂解操作，4 ℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。加逆轉(zhuǎn)錄酶后， 37 ℃孵育60 min生成cDNA。進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增 ，反應(yīng)設(shè)置為：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、55 ℃ 2 min，共40個(gè)RT-PCR循環(huán)。

采用羅氏檢測公司生產(chǎn)的multipical多態(tài)性檢測試劑盒，在相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行單堿基的序列檢測。使用ABI1310進(jìn)行PCR跑膠電泳，儀器購自美國Life Technologies公司，采用GENEMAPPER軟件進(jìn)行對比分析，儀器購自美國Life Technologies公司。

采集入院后靜脈血，離心后收集上清液，采用免疫發(fā)光法檢測血清中PCⅢ和ⅣC水平，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動(dòng)酶標(biāo)儀，檢測試劑盒購自南京凱基生物制劑有限公司；采用全自動(dòng)生化法檢測AST、ALT和GGT值，配套試劑購自南京凱基生物制劑有限公司。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，3組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較使用卡方檢驗(yàn)；采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)樣本群體代表性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、 各組受試者一般特征比較

對照組、嗜酒組和ALD組性別、年齡等一般特征比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組一般特征比較

二、 基因多態(tài)性檢測

PNPLA3基因位點(diǎn)rs738409存在C/G突變，得到3種基因型，分別為CC型、GC型、GG型，見圖1。

圖1 PNPLA3基因酶切電泳圖

1：GG型；2：CG型；3，4,5,7,8，9：CC型；M：Marker

三、 各組PNPLA3基因型及等位基因比較

對照組、嗜酒組和ALD組PNPLA3基因多態(tài)型符合Hardy-Weinberg平衡定律；ALD組基因型GG型和等位基因G的比例為18.57%和39.29%，明顯高于對照組和嗜酒組(χ2=6.586和4.290，10.714和8.504，P<0.05)。見表2。

四、 ALD組不同基因型患者AST、ALT等比較

GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明顯高于CC型和CG型(P<0.05)。見表3。

討 論

ALD的發(fā)生率有逐漸上升的趨勢，特別是在有自身免疫力紊亂的人群中，ALD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)更大[6]。ALD的發(fā)生不僅能夠?qū)е赂闻K上皮細(xì)胞代謝和內(nèi)分泌功能障礙，同時(shí)還能夠增加遠(yuǎn)期惡性消化道病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，增加肝癌和膽囊癌等的發(fā)生幾率[7-8]。

PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)的改變能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞過度激活，提高了中性粒細(xì)胞對于肝臟上皮組織的損傷程度。rs738409位點(diǎn)的改變能夠通過影響PNPLA3的轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致下游炎癥因子的激活，增加了腫瘤壞死因子α對于肝臟小葉結(jié)構(gòu)或者小葉導(dǎo)管的破壞作用。基礎(chǔ)研究還認(rèn)為，PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)的改變能夠加劇T淋巴細(xì)胞的自身免疫性損傷，降低肝臟上皮細(xì)胞對于高負(fù)荷酒精的耐受程度，導(dǎo)致肝臟上皮細(xì)胞的變性程度明顯增加[9]。

由于體質(zhì)指數(shù)、飲酒量等因素可能在一定程度上影響基因多態(tài)性的結(jié)果，本研究對于不同組別患者的一般臨床資料分析表明，不同組在體質(zhì)指數(shù)、年齡、飲酒量等方面并無明顯的差異，排除了相關(guān)因素對于統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果的影響，體現(xiàn)了本研究的科學(xué)性。等位基因的分析顯示，主要以CC型、GC型、GG型為主，其中ALD組基因型GG型和等位基因G明顯高于對照組和嗜酒組，差異較明顯，提示了基因型GG型和等位基因G對于ALD的發(fā)生可能具有顯著的促進(jìn)作用。這主要與以下幾個(gè)方面的病理作用有關(guān)：(1)基因型GG型和等位基因G的上升能夠?qū)е翽NPLA3轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)，誘導(dǎo)肝臟上皮細(xì)胞膜修復(fù)能力下降，在持續(xù)性較高乙醇濃度的損傷下，肝臟上皮細(xì)胞的持續(xù)性凋亡更顯著；(2)基因型GG或者等位基因G的上升能夠?qū)е赂闻K上皮細(xì)胞線粒體功能的不足，影響到上皮細(xì)胞的能量利用，導(dǎo)致其對于乙醇的代謝和分解能力明顯下降。 王健等[10]研究者也探討了基因多態(tài)性與肝病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在肝病小鼠模型中，PNPLA3基因多態(tài)性的比例可平均上升30%以上。PCⅢ和ⅣC是評估肝臟纖維化的指標(biāo)，本研究中GG型患者PCⅢ和ⅣC水平明顯高于CC型和CG型，提示GG基因型的ALD患者肝臟纖維化改變更明顯。這主要由于基因型GG型能夠?qū)е赂闻K上皮間質(zhì)中成纖維細(xì)胞的成熟，并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)肝臟病變的持續(xù)性進(jìn)展。 AST、ALT和GGT是評估患者肝功能的指標(biāo)，本研究中并未發(fā)現(xiàn)GG基因型與AST、ALT和GGT的關(guān)系，提示基因多態(tài)性并不能顯著影響肝功能水平。

表2 各組PNPLA3基因型及等位基因比較

表3 ALD組不同基因型患者AST、ALT等比較

注：a與CC型比較P<0.05；b與CG型比較P<0.05