李俊 郭旭利 黃維甄

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)為肝臟常見惡性實(shí)體瘤之一，其發(fā)病率位居癌癥第二位[1-2]。目前針對PLC的預(yù)后評估缺少敏感度、特異性均較高的生物標(biāo)志物。而研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化及侵襲，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程[3]。目前國內(nèi)鮮有應(yīng)用miR-375和miR-146a評估PLC預(yù)后的研究。因此本研究通過檢測PLC患者血清中miR-375和miR-146a的表達(dá)情況，分析其在PLC預(yù)后評估中的價值及意義，為臨床提供參考。

資料和方法

一、 一般資料

選擇2015年9月至2017年3月我院收治的65例PLC患者(PLC組)、49例乙型肝炎肝硬化患者(肝硬化組)、51例乙型肝炎患者(肝炎組)及47名同期健康體檢者(健康對照組)作為研究對象。65例PLC患者均經(jīng)穿刺活檢病理確認(rèn)，男性32例、女性33例，年齡(53.2±6.7)歲，肝功能Child-Pugh分級A級57例、B級8例。肝硬化組男性23例、女性26例，年齡(51.5±7.0)歲。肝炎組男性22例、女性29例，年齡(52.2±7.4)歲。健康對照組男性27例、女性20例，年齡(54.6±6.9)歲。四組受試者在性別(c2=2.128，P=0.546)、年齡(F=1.792，P=0.150)方面具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受肝動脈栓塞化療術(shù)(TACE)；②檢測血清miR-375、miR-146a前未使用過化療藥物、靶向藥物或接受過放療；③無治療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物或酒精性肝損傷者；②活動性肝炎患者。本研究受試者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

(一)血清miR-375、miR-146a表達(dá)量檢測

采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測PLC患者血清miR-375、miR-146a相對表達(dá)量。具體步驟如下：①抽取四組受試者空腹靜脈血，離心，提取上層血清；②用總RNA提取試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]提取血清中總RNA，A260/A280在1.8～2.0之間；③用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(美國Applied Biosystems公司) 合成cDNA，95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)40 次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct表示miR-375、miR-146a的相對表達(dá)量。

(二) 肝動脈栓塞化療術(shù)

首先股動脈穿刺，將導(dǎo)管插至肝固有動脈和其分支處。進(jìn)行造影，觀察并確定腫瘤供血動脈。確定腫瘤供血動脈后將導(dǎo)管插入腫瘤供血動脈，在X線下將化療藥物吡喃阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，H33021980)10～30 mg和順鉑(齊魯制藥有限公司，H37021358)20 mg注入腫瘤供血動脈，栓塞。術(shù)后，再次進(jìn)行造影，檢查栓塞程度。根據(jù)患者治療情況確定TACE治療次數(shù)、時間間隔。

(三)隨訪

采用電話隨訪對65例PLC患者進(jìn)行1年的跟蹤隨訪，了解患者生存情況。隨訪期間，無1例失聯(lián)。

三、 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理及分析，服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，PLC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組四組間計量資料比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)；PLC患者治療前后計量資料比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線評價miR-375、miR-146a診斷PLC患者生存預(yù)后的效能。采用Kaplan-Meier和Cox多因素回歸分析PLC患者生存的獨(dú)立影響因素。當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 miR-375、miR-146a在四組受試者血清中的表達(dá)量比較

PLC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組血清中miR-375的表達(dá)量分別為(0.3±0.1)、(0.6±0.2)、(0.9±0.3)和(0.9±0.2)，四組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=111.247，P<0.001)。 其中，PLC組患者血清miR-375表達(dá)量低于肝硬化組、肝炎組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=10.179、21.136、22.165，P<0.01)；肝炎組患者血清miR-375表達(dá)量與健康對照組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.435，P>0.05)。miR-146a在PLC組、肝硬化組、肝炎組和健康對照組血清中的表達(dá)量分別為(4.2±0.8)、(2.7±0.5)、(1.2±0.4)和(1.0±0.2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=412.194，P<0.001)。 PLC組患者血清miR-146a表達(dá)量高于肝硬化組、肝炎組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=19.945、41.012、42.442，P<0.01)；肝炎組患者血清miR-146a表達(dá)量與健康對照組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.248，P>0.05)。詳見圖1。

二、 PLC患者治療前后血清miR-375、miR-146a表達(dá)量變化

PLC組患者經(jīng)TACE后血清miR-375表達(dá)量為(0.5±0.2)，較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.658，P<0.001)；血清miR-146a表達(dá)量為(3.2±0.7)，較治療前降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.832，P<0.001)。

三、 PLC患者1年期生存情況

65例PLC患者均接受TACE，其1年生存率為81.5%(53/65)。

四、 PLC患者1年內(nèi)生存組患者與死亡組患者血清miR-375、miR-146a表達(dá)量

生存組患者血清miR-375、miR-146a表達(dá)量分別為(0.3±0.1)和(3.9±0.6)，死亡組患者血清miR-375、miR-146a表達(dá)量分別為(0.2±0.1)和(5.3±0.6)，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.408、6.456，P<0.001)。

圖1 miR-375、miR-146a在PLC、肝硬化、肝炎患者和健康對照組血清中的表達(dá)水平

五、 血清miR-375、miR-146a表達(dá)量診斷PLC 1年生存期的效能

miR-375診斷PLC 1年生存期的AUC小于miR-146a，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.554，P=0.120)。miR-375、miR-146a聯(lián)合檢測的效能高于miR-375，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.684，P=0.007)；miR-375、miR-146a聯(lián)合檢測的AUC略大于miR-146a，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.535，P=0.592)。詳見圖2和表1。

圖2 miR-375、miR-146a診斷PLC 1年生存期的ROC曲線

六、 影響PLC患者1年生存期的因素

對可能影響PLC患者1年生存期的因素行單因素分析，結(jié)果顯示，病灶大小、白蛋白水平、Child-Pugh分級、miR-375和miR-146a表達(dá)量與PLC患者1年生存期有關(guān)。將單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)帶入Cox多因素回歸分析，結(jié)果表明，病灶大小、miR-375和miR-146a表達(dá)量是PLC患者1年生存期的獨(dú)立影響因素。詳見表2。

討 論

有研究表明，聯(lián)合檢測PTEN和EpCAM水平有助于預(yù)測肝癌預(yù)后和復(fù)發(fā)，但該方法需要獲取肝臟癌變細(xì)胞，操作繁瑣且評估預(yù)后效能較差[4]。既往研究指出，微RNA檢測對多種腫瘤疾病預(yù)后均具有較高的敏感度及準(zhǔn)確性，但國內(nèi)未見應(yīng)用微RNA診斷PLC預(yù)后的報道。因此，本研究檢測PLC血清中miR-375和miR-146a的表達(dá)，探究其對PLC患者預(yù)后的價值。

miR-375基因?qū)儆诨蜷g型的miRNA，其位于2號染色體長臂2區(qū)3帶，Cryba2基因和Ccdc108基因之間。有研究顯示[5]，miR-375在PLC患者中的表達(dá)水平較癌旁組織低。本研究顯示，PLC患者血清miR-375表達(dá)量低于肝硬化組、肝炎組和健康對照組，提示檢測血清miR-375水平有助于鑒別PLC。miR-146a亦為miRNA家族一員，其位于第五號染色體LOC285628基因的第二個外顯子區(qū)。有研究證實(shí)[6]，miR-146a在肝癌中表達(dá)異常升高。本研究顯示，PLC患者血清miR-146a表達(dá)量高于肝硬化組、肝炎組和健康對照組，提示miR-146a在血清中的特異性表達(dá)，對PLC具有診斷價值，可能原因?yàn)閙iR-146a的高表達(dá)抑制FOXO1基因在肝臟癌變細(xì)胞的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂分化。

表1 miR-375、miR-146a診斷PLC 1年生存期的效能

表2 PLC患者1年生存期的影響因素分析

本研究中死亡組患者miR-375水平低于生存組患者，miR-146a水平高于生存組患者，提示miR-375和miR-146a可能與PLC患者預(yù)后存在聯(lián)系，可能原因?yàn)閙iR-375通過靶向抑制AEG-1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G1期阻滯和細(xì)胞凋亡；miR-146a可以通過干擾c-Myc表達(dá)而促使肝臟癌變細(xì)胞的增殖分化。

有研究指出[7-8]，miR-375和miR-146a的異常表達(dá)對PLC患者的預(yù)后判斷具有較高的敏感性和特異性，均可作為PLC的標(biāo)志物。本研究顯示，miR-375、miR-146a聯(lián)合檢測的效能均高于單行miR-375或miR-146a檢測，提示僅行miR-375或miR-146a檢測雖存在一定價值，但均低于二者聯(lián)合檢測的AUC，故聯(lián)合檢測miR-375、miR-146a表達(dá)更有助于PLC預(yù)后評估。此外，經(jīng)生存分析得知，病灶大小、miR-375和miR-146a表達(dá)量與PLC患者生存預(yù)后密切相關(guān)，提示臨床治療應(yīng)密切觀察PLC患者血清miR-375和miR-146a表達(dá)量。

本研究存在以下不足：樣本量偏少，結(jié)果可能存在一定的隨機(jī)性和偶然性；單中心研究，抽樣誤差大。下一步將進(jìn)行多中心研究、增加樣本例數(shù)，進(jìn)一步闡明miR-375和miR-146a在PLC患者預(yù)后評估中的價值。