周保倉(cāng)

慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒(HBV)檢測(cè)為陽(yáng)性，病程超過(guò)半年而伴有慢性肝炎典型臨床表現(xiàn)[1]。臨床上反映肝功能的轉(zhuǎn)氨酶實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、ALT/AST比值、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等13項(xiàng)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶在反映肝細(xì)胞功能方面并不具有直接的指向性意義，二者間的關(guān)系受到較多混雜因素的干擾，而病理活檢由于其準(zhǔn)確性和特異度較好，往往是診斷各項(xiàng)疾病采用的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。本研究擬選取轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度增高的慢性乙型肝炎患者，對(duì)其進(jìn)行肝穿刺活檢病理特征分析。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選取2013年2月至2017年1月我院傳染科收治的慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎的判定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)HBV檢測(cè)為陽(yáng)性；(2)病程超過(guò)半年；(3)典型臨床表現(xiàn)：大部分患者可有乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀。轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度增高的判定標(biāo)準(zhǔn)為：ALT水平0～65 U/L或AST水平0～60 U/L。符合以下情況當(dāng)中任意一種的患者需剔除：(1)合并甲型、丙型、丁型、戊型等其他肝炎病毒重疊感染者；(2)自身免疫性肝病患者；(3)酒精性或藥物依賴性肝病患者。

二、方法

活檢穿刺設(shè)備型號(hào)為Bard51BS0672型。

經(jīng)所有受試者同意行肝穿刺活檢。術(shù)前密切監(jiān)測(cè)患者B超肝穿刺定位、凝血酶原時(shí)間、各項(xiàng)血常規(guī)值等。穿刺活檢獲得肝組織后均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、蘇木-伊紅染色進(jìn)行制片；肝組織炎性壞死及纖維化程度的分期參考《病毒性肝炎防治指南(2015年版)》。同時(shí)提取患者肝組織HBV DNA。(1)去除石蠟：將石蠟包埋組織切成5～10 μm后，用滅菌小鑷子(使用前用UV照射10 min以上)將3張切片放入1.5 mL Eppendorf管中，將1 mL二甲苯(去除石蠟)加入Eppendorf管中，蓋好蓋子，漩渦振蕩10 s，4 000 r/min室溫離心2 min，去上清，然后添加1 mL無(wú)水乙醇(去除二甲苯)，漩渦振蕩混勻，14 000 r/min，室溫離心2 min，棄上清，打開(kāi)蓋子，在室溫最高至37 ℃時(shí)孵育10 min，直至無(wú)乙醇?xì)埩簟?2)裂解：加入180 μL BufferGTL，使以上沉淀重懸，加入20 μL ProteinaseK，漩渦振蕩混勻，56 ℃消化過(guò)夜，使組織徹底消化，在一定程度上可提高DNA產(chǎn)量。樣本通過(guò)蛋白酶K消化，在變形條件下裂解。(3)加熱：在70 ℃下孵育1 h，逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底，將以上溶液注入到吸附柱上，蓋好管蓋，8 000 r/min離心1 min，棄上清。(4)結(jié)合：小心打開(kāi)管蓋，向吸附柱中加入550 μL Buffer GW2(使用前添加無(wú)水乙醇)，蓋好管蓋，8 000 r/min，離心1 min棄上清，再14 000 r/min離心3 min，將DNA結(jié)合到硅膠膜上，雜質(zhì)不結(jié)合。(5)洗滌：將75 μL Buffer GE溶液加入吸附柱膜中，室溫放置5 min，14 000 r/min離心1 min，再重復(fù)以上步驟1次，將殘留的污染物洗掉，收集DNA溶液。(6)提取：所得液體即為DNA樣品，分裝于干凈消毒的1.5 mL Eppendorf，-20 ℃凍存保存。HBV DNA的提取等工作由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用率、構(gòu)成比、相對(duì)比、均數(shù)、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。計(jì)量資料服從正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)進(jìn)行比較；不服從正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立或多組樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法及Spearman等級(jí)相關(guān)對(duì)病理學(xué)分級(jí)、分期與HBV DNA水平等資料的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。無(wú)特殊說(shuō)明情況下顯著性水平α=0.05，所有P值表示雙側(cè)概率。

結(jié) 果

一、受試者一般資料

本研究共收集到慢性乙型肝炎患者152例，患者平均年齡(35.90±7.55)歲，其中男性86例(56.58%)，HBsAg(+)患者96例(63.16%)，HBeAg(+)患者26例(17.11%)，抗Hbc(+)患者18例(11.84%)，初中及以下文化水平的患者57例(37.50%)，有家族史的患者25例(16.45%)，有高危性生活史的患者41例(26.97%)，有輸血史的患者22例(14.47%)，有創(chuàng)傷性美容史的患者35例(23.03%)，有手術(shù)史的患者76例(50.00%)。

二、慢性乙型肝炎患者炎癥分期影響因素的單因素分析

采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法對(duì)不同分類群體中慢性乙型肝炎患者炎癥各分期人數(shù)構(gòu)成比進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，性別、年齡、是否HBsAg陽(yáng)性、是否HBeAg陽(yáng)性、是否抗HBc陽(yáng)性、家族史、創(chuàng)傷性美容史、手術(shù)史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者炎癥分期的影響因素(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 慢性乙型肝炎患者炎癥分期影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

三、慢性乙型肝炎患者纖維化分期影響因素的單因素分析

對(duì)不同分類群體中慢性乙型肝炎患者纖維化各分期人數(shù)構(gòu)成比進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，性別、年齡、是否HBsAg陽(yáng)性、是否HBeAg陽(yáng)性、家族史、創(chuàng)傷性美容史、手術(shù)史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者纖維化分期的影響因素(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

四、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影響因素的單因素分析

既往研究報(bào)道，由于DNA定量測(cè)定結(jié)果本身不具有較好的正態(tài)分布性，但可經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使其近似服從正態(tài)分布(P>0.05)，故此處先對(duì)原始定量結(jié)果取對(duì)數(shù)后進(jìn)行單因素分析。若經(jīng)轉(zhuǎn)換后仍不服從正態(tài)分布則采用兩獨(dú)立或多組樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析。結(jié)果顯示，年齡、是否HBsAg陽(yáng)性、是否HBeAg陽(yáng)性、家族史、創(chuàng)傷性美容史、手術(shù)史、輸血史及高危性生活史是慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量的影響因素(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 慢性乙型肝炎患者纖維化分期影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

五、慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量水平與其病理特征的相關(guān)性

采用Spearman等級(jí)相關(guān)對(duì)病理學(xué)分級(jí)、分期與HBV DNA水平等級(jí)(取所有HBV DNA定量水平對(duì)數(shù)后，以其中位數(shù)作為閾值將HBV DNA水平分為高低兩水平)資料的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，HBV DNA水平等級(jí)與炎癥等級(jí)呈正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.314，P<0.05)，而與纖維化等級(jí)的相關(guān)系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.178，P>0.05)。

表3 慢性乙型肝炎患者HBV DNA定量影響因素的單因素分析(n=152)

注：*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

討 論

有研究表明，慢性乙型肝炎患者肝臟病理炎癥分級(jí)、外周微循環(huán)變化以及纖維化程度分期密切相關(guān)，而目前肝穿刺組織活檢仍然是判定慢性肝炎炎癥、纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，1%的肝細(xì)胞發(fā)生損傷后就能使血清ALT濃度增高1倍；因此，ALT可以作為肝功能損害的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，其輕度升高可以作為疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志[4]。研究表明，ALT越高，肝炎疾病及纖維化的進(jìn)展發(fā)生率就越高，但是如果免疫反應(yīng)僅引起炎癥和纖維化，未損傷肝細(xì)胞，肝細(xì)胞漿內(nèi)的酶未釋放入血，血清轉(zhuǎn)氨酶可不升高[5]。

本研究年齡、是否HBsAg陽(yáng)性等一系列因素均與炎癥及纖維化病變存在關(guān)聯(lián)。其原因可能是乙型肝炎患者可以通過(guò)不同的途徑感染乙肝引起病理學(xué)變化，且創(chuàng)傷性美容史、手術(shù)史、輸血史等均能夠直接誘發(fā)外源性感染，最終造成肝臟炎癥甚至纖維化的發(fā)生[6]。病理學(xué)分級(jí)、分期與HBV DNA水平等級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，HBV DNA水平等級(jí)與炎癥等級(jí)呈正相關(guān)。其原因可能是機(jī)體感染的時(shí)間延長(zhǎng)，病毒在體內(nèi)的拷貝數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，繼而導(dǎo)致免疫復(fù)合物急性沉著在肝組織導(dǎo)致栓塞形成，引起急性肝壞死而導(dǎo)致死亡，從而誘發(fā)炎癥病理反應(yīng)[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBV DNA水平等級(jí)與纖維化等級(jí)不具有相關(guān)性。其可能是因?yàn)闄C(jī)體代償能力不足以應(yīng)付病變速度的結(jié)果，通常只有在疾病進(jìn)展到不可逆的階段才發(fā)生。轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度增高的慢性乙型肝炎患者及時(shí)并且全程接受抗病毒治療，HBV DNA水平還是可以及時(shí)得到控制，病情逆轉(zhuǎn)的概率很大，因此二者的相關(guān)性可能不是很明顯[8]。