歐陽考濱 袁霞 何櫻

2013年我國肝癌死亡例數達35.81萬，占全世界因肝癌死亡人數的43.9%[1]。微小RNA(miRNA)是一類小型內源性非編碼RNA調控因子，長度為18～25個核苷酸，目前在人類基因組中發(fā)現超過1500個miRNA，其在細胞分化、細胞周期和凋亡的調控過程中發(fā)揮重要作用。miRNA的異常表達可以調節(jié)數十至數百個靶基因以協調細胞信號傳導途徑，影響下游靶基因表達，從而促進細胞增殖、侵襲和遷移等生物學過程，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,3]。miR-509-3p作為腫瘤抑制因子，在膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、急性淋巴細胞白血病、肺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4,5]。盡管已有較多關于肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究，但miR-509-3p及其靶基因在調節(jié)肝細胞癌增殖和侵襲中的作用機制還需要進一步探討。腫瘤細胞凋亡抵抗的機制之一是其高表達凋亡抑制蛋白，該家族包括XIAP、Survivn、Livin等成員，可以通過多種機制發(fā)揮抑制凋亡的作用[6]。XIAP為X連鎖凋亡抑制蛋白，在膠質瘤研究中發(fā)現miR-509-3p具有負性調節(jié)XIAP表達的作用[4]，而在肝細胞癌中的報道較少。本研究通過觀察肝細胞癌中miR-509-3p和XIAP異常表達對肝癌細胞增殖與侵襲能力的影響，初步探索其作用機制。

材料與方法

一、一般資料

選取2013年4月至2015年4月于惠州市中心醫(yī)院經病理確診的肝細胞癌患者107例，男71例，女36例，年齡34～67歲，平均(42.1±6.5)歲。所有患者均為初次診治，手術之前未接受過化療、放療等，未合并其他惡性腫瘤。Ⅰ期21例、Ⅱ期32例、Ⅲ期38例、Ⅳ期16例。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

二、細胞培養(yǎng)及細胞轉染

于培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)皿中接種HepG2細胞，內含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱中，當細胞密度達90%時，利用胰蛋白酶消化細胞并接種傳代。轉染前24 h，接種適當數量的細胞至6孔板中，使轉染時的細胞密度達到70%～80%。將Lipo2000室溫靜置6 min，然后分別與配好的miR-509-3p類似物、miR-509-3p抑制物及XIAPsiRNA混勻，室溫下靜置20 min，將其加入接種的6孔板中，混和后置于培養(yǎng)箱，6 h后加新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細胞。每組實驗至少重復3次。

三、RT-PCR檢測組織及細胞中miR-509-3p及XIAP的表達

Trizol法提取患者癌組織、癌旁組織及細胞中總RNA。以5 μL總RNA為模板，用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄，總反應體系為15 μL(cDNA 2 μL，TaqDNA聚合酶2.5 μL，上下游引物0.5 μL，雙蒸水10 μL)，反應條件如下：95 ℃ 10 s，90 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，連續(xù)40個循環(huán)。用相對Ct值分析數據，目的基因miR-509-3p mRNA的表達相對于內參基因U6的比值為2-ΔΔCt，計算miR-509-3p的相對定量表達水平。miR-509-3p正向引物序列：5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，反向引物序列：5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′；miR-509-3p類似物正向引物序列：5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，反向引物序列：5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′；XIAP正向序列5′-GACAGTATGCAAGATGA-GTCAAGTCA-3′，反向序列5′-GCAAAGCTTCT-CCTCTTGCAG-3′；XIAPsiRNA特異性正義鏈：5′-GUGCUGGACUCUACUACACUU-3′，反義鏈：5′-GUGUAGUAGAGUCCAGCACUU-3′；XIAPsiRNA非特異性正義鏈：5′-CUUGUAUGGGCAGAUUGC-CUU-3′,非特異性反義鏈：5′-GGCAAUCUGCCCA-UACAAGUU-3′；內參基因U6上游序列:5′-GCTT-CGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游序列:3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。miR-509-3p及XIAP反轉錄引物、PCR引物和探針分別來自ABI生物公司。所有反應均在ABI實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。

四、細胞增殖及細胞侵襲力檢測

1．細胞增殖實驗：實驗過程按試劑盒說明書進行，將細胞以每孔100 μL培養(yǎng)基中含3000個細胞的密度接種到96孔板中，接種24、48、72、96及120 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑后1 h評估450 nm處的吸光度，以確定細胞的增殖能力。細胞增殖能力以活細胞相對于媒介物處理細胞的百分比表示，實驗至少重復3次。

2．細胞侵襲能力檢測(Transwell小室實驗)：將轉染miR-509-3p類似物的HepG2細胞及無任何處理的HepG2細胞接種到Transwell小室上室，上室每孔接種200 μL不含血清細胞懸液(2×104個)，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為化學誘導劑。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后結晶紫染色，200倍光學顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察穿透過濾器的被染色細胞數目，以評估細胞的侵襲和遷移能力，結果取均值，實驗至少重復3次。

五、統計學方法

結 果

一、癌組織與癌旁組織miR-509-3p與XIAP mRNA表達及癌組織中二者相關性分析

肝癌組織miR-509-3p與XIAP的相對表達量分別為0.415±0.098、1.657±0.147，癌旁組織miR-509-3p與XIAP的相對表達量分別為1.127±0.126、0.425±0.113，癌組織中miR-509-3p相對表達量較癌旁組織顯著較低(t=3.257，P=0.002)，而XIAP的相對表達量顯著較高(t=4.201,P=0.000)。肝癌組織miR-509-3p與XIAP mRNA表達水平呈負相關(r=0.218，P=0.046)，見圖1、2。

圖1 肝癌組織與癌旁組織miR-509-3p、XIAP表達比較

圖2 肝癌組織miR-509-3p與XIAP表達相關性分析

二、miR-509-3p表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響

與對照組相比，轉染miR-509-3p類似物48、72、96及120 h時，HepG2細胞增殖率明顯降低(均P<0.05)；與對照組相比，轉染miR-509-3p抑制劑48 h后HepG2細胞增殖明顯增高(均P<0.05)，見圖3。與對照組相比，轉染miR-509-3p類似物后24 h HepG2細胞侵襲數目明顯較低(分別為96.32±0.52，51.47±0.45，t=2.263,P=0.021)；與對照組相比，轉染miR-509-3p抑制劑后24 h HepG2細胞侵襲數目明顯較高(分別為94.65±0.42，120.14±0.45，t=2.463，P=0.013)。

三、siRNA沉默XIAP表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響

與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA沉默XIAP基因表達后48、72、96和120 h，HepG2細胞增殖和侵襲能力均顯著較低(P均<0.05)。見表1。

圖3 轉染miR-509-3p類似物和抑制劑后各時間點HepG2細胞增殖率

表1 siRNA沉默XIAP表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力影響

討 論

miRNA是近年來腫瘤研究的熱點，其可通過結合目標基因mRNA的3′非翻譯區(qū)，誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯發(fā)揮作用，影響細胞分化、增殖、侵襲和凋亡等過程[7,8]。多種miRNA的異常表達(上調或下調)與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展相關，miRNA參與多條細胞信號轉導通路的調節(jié)，如TGF-β通路、JAK/STAT信號通路傳導通路等，參與肝癌細胞增殖、凋亡、轉移等生物學過程[9-11]。有研究表明，在惡性膠質瘤、卵巢癌、胃癌等組織中均存在miR-509-3p顯著下調的現象，并且下調程度可能影響患者長期總體生存率，體外實驗中通過上調miR-509-3p的表達后，腫瘤細胞的增殖和遷移能力受到抑制，而敲除或下調miR-509-3p表達后，腫瘤細胞的增殖和遷移能力增強[12]。本研究發(fā)現，肝癌組織中miR-509-3p表達量顯著低于癌旁組織，表明肝細胞癌的發(fā)生可能與miR-509-3p的表達水平降低有關。進一步在體外細胞實驗中證實，通過轉染miR-509-3p類似物上調miR-509-3p表達后，HepG2細胞增殖和侵襲能力明顯降低，而轉染miR-509-3p抑制物下調miR-509-3p表達后，HepG2細胞增殖和侵襲能力明顯升高。本研究與Yoon等[13]報道的體外實驗的數據一致，其機制可能是miR-509-3p的過表達誘導G1細胞周期阻滯，并通過下調CDK2、Rac1及磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞基2α的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。有學者在舌鱗癌的研究中發(fā)現，miR-509可調節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)基因的表達，進而影響EGFR信號轉導通路中下游基因如p-Akt的表達發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[14]。

XIAP是細胞凋亡抑制因子家族中的重要成員，該家族包括XIAP、NAIP、survivin及c-IAP1等成員，由三個BIR結構域和一個環(huán)指結構域構成，它能夠通過將caspase-3和caspase-7結合到其XIAP BIR2結構域抑制caspase-3和caspase-7活性，并通過將caspase-9結合到其BIR3結構域來抑制caspase-9[15]。XIAP在乳腺癌、非小細胞型肺癌、卵巢癌等許多類型的癌癥中表達升高[16-18]。本研究中肝癌組織XIAP表達量與癌旁組織相比顯著較高。進一步通過RNA干擾的方法沉默XIAP表達，結果表明siRNA沉默XIAP基因表達后HepG2細胞增殖和侵襲能力均顯著降低。其機制可能是肝癌組織中XIAP表達增高，滅活caspase-3、7、9等關鍵半胱氨酸蛋白酶，細胞抗凋亡能力增強。XIAP還含有一個環(huán)指結構，具有泛素連接酶(E3)的活性，XIAP的E3連接酶可通過對c-Jun / AP-1的反式激活作用，上調細胞周期蛋白D1轉錄，進而影響細胞凋亡、增殖和遷移等信號級聯反應，而當下調XIAP表達時，細胞周期蛋白D1表達降低，細胞增殖減弱[19,20]。此外，XIAP通過調節(jié)CDK4/CDK6/CyclinD1復合物的表達，進而促進肝癌細胞的增殖，在用embelin(XIAP特異性抑制劑)對肝癌細胞處理后，腫瘤細胞增殖明顯受到抑制[21,22]。

miRNA通過結合靶基因的3'-UTR起作用，本研究初步探討肝癌組織中miR-509-3p表達與癌組織中的XIAP表達的相關性，結果表明miR-509-3P表達與XIAP表達呈負相關，其機制可能與miR-509-3P負性調節(jié)靶基因XIAP的表達有關[4]，與國內學者報道結果一致[23]。有研究通過熒光素酶報告實驗表明XIAPmRNA存在miR-509-3P結合位點，轉染miR-509-3P 類型物后腫瘤細胞XIAP蛋白表達明顯降低，進一步激活凋亡信號轉導等通路，細胞凋亡增多[24]。

綜上所述，與癌旁組織相比，miR-509-3p在肝癌組織樣本中表達下調，并且miR-509-3p的低表達水平可能增加肝癌細胞的增殖和侵襲能力。miR-509-3p作為一種腫瘤抑制因子，可能通過在肝癌細胞中靶向XIAP來抑制細胞增殖和侵襲，其具體作用機制有待深入研究。