■ 吳桐強 胡 毅 * 鐘 蕾 陳 團 ，3 陳云飛 ，3 曹曉莉 戴振炎

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；3.通威股份有限公司，四川成都 610041）

碳水化合物是為生命體提供熱能的三種主要營養(yǎng)素中最廉價的營養(yǎng)素。在魚體內(nèi)，碳水化合物作為能量消耗的利用較蛋白質(zhì)和脂肪低。而相對于蛋白質(zhì)和脂肪，碳水化合物則容易獲得，且能顯著降低飼料成本。但是，攝入高碳水化合物通常會導(dǎo)致魚體出現(xiàn)肝腫大、肝糖原累積、生長性能下降[1]，并且認為，魚類耐糖機能低下的原因是胰島素量分泌不足導(dǎo)致的[2]。然而也有大量的研究認為參與魚類糖類代謝的酶也是其中的主要影響因素。在大菱鲆上的研究得出，GK在高糖情況下(添加量為28%)活性呈下降趨勢，PK也出現(xiàn)了類似的情況[3]。對翹嘴紅鲌的研究表明，攝食高碳水化合物飼料可提高GK的活性及基因的表達[4]。草魚因易飼養(yǎng)、草食性、生長快、群體產(chǎn)量高，近年來已成為淡水養(yǎng)殖的當家品種之一。與肉食性和雜食性魚類相比，草食性魚類對糖的利用較高。研究發(fā)現(xiàn)，草魚能夠利用飼料中37%～56%的碳水化合物水平，對其生長沒有顯著影響[5]。然而，在本試驗的前期研究中，當飼料碳水化合物水平高于37%后，草魚增重率下降，同時，肝體比和肝糖原含量升高，顯著影響了草魚的生長性能[6]。鑒于此，本試驗以小麥和小麥麩為碳水化合物源，研究了高碳水化合物水平（CHO＞37%）對大規(guī)格草魚糖代謝相關(guān)的激素和酶的影響，為探索高糖水平下，大規(guī)格草魚生長性能下降提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼料配制

以小麥和小麥麩為主要糖源，玉米蛋白粉、進口DDGS、豆粕和菜粕為蛋白源，保持每種飼料蛋白源在總蛋白源中比例一致，試驗共設(shè)置7個處理組，設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30%、28%、26%、24%、22%、20%、18%，碳水化合物（無氮浸出物）水平依次為31%、34%、37%、40%、43%、46%、49%，配制成7種全價配合膨化飼料，分別為P30C31(C1組)、P28C34(C2組)、P26C37(C3組)、P24C40(C4組)、P22C43(C5組)、P20C46(C6組)、P18C49(C7組)。試驗飼料由通威股份有限公司南昌分公司提供，飼料原料使用利達超微粉碎機粉碎，粉碎細度達到80%，過80目篩，通過牧羊混合機，混合均勻度為5.2%，最后通過恒潤145雙螺桿膨化機膨化，制作粒徑為4.0的膨化飼料，試驗飼料配方及營養(yǎng)水平如表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在湖南省婁底市新化縣車田江水庫網(wǎng)箱進行。試驗魚種購于湖南省岳陽市湘陰縣某苗種場，魚種暫養(yǎng)于5 m×4 m×5 m的網(wǎng)箱中。試驗網(wǎng)箱采用聚乙烯網(wǎng)箱，大小為2 m×2 m×2 m。試驗開始時挑選規(guī)格均勻、體格健康的草魚分兩輪進行分箱，試驗共7個處理，每個處理設(shè)置三個平行，共21個網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱放草魚30尾，魚初始體重為(398.6±5.9)g。試驗期間水溫為（26.1±2.12）℃。溫度低于25℃時以草魚體重的1%～2%投喂，日投喂兩次（8：30～10：00、15：30～17：00），早晚比例為40%、60%；水溫高25℃時以草魚體重的3%投喂，日投喂三次（7:00～8：00、11：00～12:00、17：00～18：00），早中晚比例為20%、35%、45%。投喂方法為人工手撒，每次分多批投喂。每天記錄天氣、水溫、草魚的攝食以及死亡情況。試驗周期為16周。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后，饑餓24 h，從每個網(wǎng)箱隨機抽取6尾草魚，用丁香油麻醉（1∶10 000）后從尾靜脈取血，裝于1.5 ml離心管中4℃靜置過夜，然后3 000 r/min離心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，用于血清胰島素和胰高血糖素的測定；根據(jù)前期研究結(jié)果，高碳水化合物水平飼料會導(dǎo)致魚體肝體比、臟體比、腸體比以及肌肉和肝臟脂肪含量升高（胡毅，2018）[6]，因此選擇正常碳水化合物水平C1（CHO 31%）、C2（CHO 34%）、C3（CHO 37%）組和高碳水化合物水平C7（CHO 49%）組，解剖腹腔，取出完整的內(nèi)臟，分離出肝臟，保存于-80℃冰箱，用于測定肝臟糖代謝酶活性。

1.4 指標測定

1.4.1 血清胰島素和胰高血糖素的測定

血清胰島素和胰高血糖素含量均采用上海研輝生物科技公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行測定。

1.4.2 肝臟酶活性測定

稱取一定重量的肝臟，用PBS溶液清洗肝臟組織，然后將肝臟組織放入10 ml的勻漿管中，按1∶9的比例加入9倍體積的PBS（pH值7.4），用勻漿器將組織勻漿充分。3 000 r/min 4℃離心20 min，收集上清液用于草魚肝臟糖代謝相關(guān)酶的測定。己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖激酶（GK）、磷酸果糖激酶（PFK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、1,6-二磷酸果糖酶（FBPase）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的測定均采用上海研輝生物科技公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan's法多重比較組間差異性，當P＜0.05時表示差異顯著，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對大規(guī)格草魚糖代謝激素的影響（見圖1）

圖1 不同碳水化合物水平飼料對大規(guī)格草魚血清胰島素和胰高血糖素的影響

由圖1可知，投喂不同碳水化合物日糧16周后，與正常C1～C3(31%～37%CHO)組相比，高碳水化合物C4～C7(40%～49%CHO)組草魚血清胰島素、胰高血糖素含量呈升高趨勢，其中C4組胰島素含量顯著高于C3組(P＜0.05)，C4和C7組胰高血糖素含量顯著高于正常組(P＜0.05)。

2.2 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對大規(guī)格草魚肝臟糖酵解指標的影響(見圖2)

由圖2可知，各飼料組碳水化合物水平對PFK、PK活性無顯著性影響（P＞0.05）。與正常C3(37%CHO)組相比，高碳水化合物C7(49%CHO)組GK活性顯著降低(P＜0.05)。與正常C1、C3(31%、37%CHO)組相比，高碳水化合物C7(49%CHO)組HK活性顯著降低(P＜0.05)。

2.3 日糧中不同碳水化合物和蛋白水平膨化飼料對大規(guī)格草魚肝臟糖異生指標的影響（見圖3）

圖2 不同碳水化合物水平飼料對大規(guī)格草魚GK、HK、PFK和PK活性的影響

圖3 飼料中不同糖源及水平對大草魚中肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的影響

由圖3可知，各飼料組碳水化合物水平對PEPCK無顯著影響（P＞0.05）。在正常C1～C3(31%～37%CHO)組，F(xiàn)BPase的活性呈升高趨勢，且C3組顯著高于C1組（P＜0.05）。而在高碳水化合物C7(49%CHO)組，F(xiàn)BPase的活性則呈降低趨勢。在正常C3(37%CHO)組中，G-6-Pase活性呈上升的趨勢，而繼續(xù)升高碳水化合物水平C7(49%CHO)組對G-6-Pase活性無顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 高碳水化合物水平膨化飼料對大規(guī)格草魚糖代謝激素的影響

胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。在哺乳動物中，胰島素是主要的合成代謝激素刺激餐后葡萄糖被外周組織如肝、骨骼肌和脂肪組織吸收。在魚類上面，則差異較大。在歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)[7]和異育銀鯽(Caras?sius auratus gibelio bloch)[8]中的研究發(fā)現(xiàn)，攝食高碳水化合物飼料，能夠顯著提高魚血清中的胰島素水平。這與本試驗研究結(jié)果基本一致，結(jié)果表明，大草魚飼料中較高的碳水化合物水平促進了胰島素的分泌。然而，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[9]上面的研究則得出攝食高糖飼料對分泌胰島素的β細胞并無影響，高碳水化合物并不能顯著促進胰島素的分泌。目前，膳食碳水化合物水平對胰島素釋放的影響存在著爭議。胰島素的釋放受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激。在本研究中，血漿胰島素水平和血糖似乎是不相關(guān)的，試驗前期研究顯示，在喂食含碳水化合物8周后的大草魚后，血液中的葡萄糖無顯著差異[6]。因此，本試驗的胰島素并未受到血糖的調(diào)節(jié)作用，而可能是胰高血糖素的分泌促進了胰島素的釋放，亦或者類似于精氨酸類的營養(yǎng)物質(zhì)更能夠?qū)σ葝u素的分泌起到促進作用[10]。魚類胰高血糖素同樣受到飼料營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)。一般認為，魚類攝入葡萄糖后，會抑制胰高血糖素的分泌。在本試驗中，胰高血糖素與胰島素有著同樣的趨勢，高碳水化合物水平促進了胰高血糖素的分泌。說明胰高血糖素并未受到血糖的調(diào)節(jié)。其原因可能與哺乳動物類似，血漿中的氨基酸水平更能夠促進魚類胰高血糖素水平[11]。

3.2 高碳水化合物水平膨化飼料對大規(guī)格草魚肝臟中糖代謝相關(guān)酶活性的影響

在糖代謝機理中，糖酵解起分解糖的作用，而糖異生則扮演糖合成的角色,兩者相互作用，才能起到維持血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。調(diào)節(jié)魚類糖酵解的關(guān)鍵酶為己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK),調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)。

魚體對碳水化合物利用低的原因,被認為是魚類GK缺乏或活性很低[12]。近來的研究表明魚類肝臟中存在GK，日糧中碳水化合物能誘導(dǎo)翹嘴紅鲌(Culter?alburnus Basilewsky)[13]、吉富羅非 魚(GIFT Oreochro?mis niloticus)[14]、瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）[15]、南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]、青魚（Mylopharyn?godn piceus）和鯽（C.anratus）[17]的GK表達量，且高碳水化合物飼料顯著增加了肝臟GK的表達量。本研究發(fā)現(xiàn)，當大草魚膨化飼料中碳水化合物水平為37%時，大草魚能夠誘導(dǎo)GK活性的提高。而當飼料碳水化合物水平從37%增加至49%時，GK活性則顯著下降。在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]中也有類似的研究結(jié)果。推測可能是膨化飼料更易于魚體對碳水化合物的消化吸收，而使得大規(guī)格草魚對碳水化合物的需求更低，因此過高的碳水化合物則抑制了GK的表達。有研究表明，HK非常保守,不受營養(yǎng)狀況和飼料碳水化合物的誘導(dǎo)[3，13，16]。在本研究中大草魚肝臟HK活性隨著膨化飼料中碳水化合物水平的升高呈先下降后上升的趨勢，說明膨化飼料中碳水化合物能夠誘導(dǎo)大草魚肝臟中HK活性的變化。但是碳水化合物水平達到37%以后，升高碳水化合物水平HK則顯著下降。因此，可認為是大規(guī)格草魚對高糖飼料的一種負反饋調(diào)節(jié)。在大黃魚（Larimichthys crocea）[18]的研究中也得出了類似的結(jié)果，在高糖水平下，HK的活性降至最低點。在大草魚試驗中，PK和PFK活性不受飼料糖含量的誘導(dǎo)，這分別與大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]等中的研究結(jié)果一致。

有研究指出，魚類攝食高碳水化合物飼料后FBPase活性無顯著變化[19]。本試驗大規(guī)格草魚肝臟FBPase活性隨著膨化飼料中碳水化合物水平的升高不斷上升，但碳水化合物水平升至49%時，F(xiàn)BPase的活性則呈下降趨勢。說明膨化飼料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性。這與在團頭魴(Megalo?brama amblycephala)[20]上的研究結(jié)果相似。一般認為，高碳水化合物水平能夠抑制葡萄糖異生，然而魚類肝臟中G-6-Pase的活性卻能隨飼料碳水化合物的增加而增強[21]。但是在鯉魚（Cyprinus carpio）[22]和大黃魚（Larimichthys crocea）[18]中的研究表明，G-6-Pase活性與日糧碳水化合物水平之間存在負相關(guān)。本試驗中，隨著碳水化合物水平升高，G-6-Pase活性呈升高的趨勢，而C7組G-6-Pase活性與C3組無顯著差異，但是有上升的趨勢。說明G-6-Pase能夠隨著碳水化合物水平的升高而升高，但是高糖下，大規(guī)格草魚能夠調(diào)控G-6-Pase活性的異常升高。FBPase是調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵酶，G-6-Pase是糖異生的第一個限速酶，膨化飼料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性且G-6-Pase活性并無顯著升高，說明大規(guī)格草魚體內(nèi)的糖異生調(diào)節(jié)機制比較完善。PEPCK是肝和腎中糖元異生的關(guān)鍵酶[23]。研究認為，低碳水化合物的飼料更能顯著提高PEPCK的活性[24]。在瓦氏黃顙魚[15]（Pelteobagrus vachelli）的研究中也得出了類似的結(jié)論，PEPCK的相對表達量，隨著飼料糖含量的增加呈下降趨勢。然而本實驗中，飼料中碳水化合物水平的增加對大草魚肝臟PEPCK無顯著影響。出現(xiàn)這種差異的原因可能跟魚的種類亦或者不同的糖源有關(guān)，具體的機制還需進一步研究探討。

4 結(jié)論

綜合考慮膨化飼料中碳水化合物水平對大規(guī)格草魚胰島素、胰高血糖素、糖代謝酶的影響，認為大規(guī)格草魚飼料中碳水化合物的適宜水平為37%，過高的碳水化合物水平會對肝臟糖酵解存在一定程度的抑制，不利于大規(guī)格草魚機體對于碳水化合物的調(diào)節(jié)。因此長期攝食高糖水平的膨化飼料可能會影響大規(guī)格草魚正常的生理功能。