鄭司浩，尚興樸，曾燕，王繼永

中國中藥有限公司，北京 102600

黃芪為豆科黃芪屬大宗常用藥材，《中華人民共和國藥典》規(guī)定黃芪藥材來源為蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[1]。膜莢黃芪資源分布較為廣泛，多分布于黑龍江、華北及西北等地區(qū)，蒙古黃芪的產(chǎn)地變遷較為復(fù)雜，目前多在山西、內(nèi)蒙古、陜西等地栽培。

黃芪作為新增的藥食同源藥材，在國內(nèi)外市場需求量逐漸增加。但蒙古黃芪與膜莢黃芪的種源較為混亂，多地出現(xiàn)蒙古黃芪與膜莢黃芪的雜交種，嚴(yán)重影響了黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。傳統(tǒng)的形態(tài)等鑒別方法很難準(zhǔn)確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的種子樣本[2-5]。前期的分子標(biāo)記等生物技術(shù)如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)、SSR(Simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列標(biāo)記)等結(jié)果可重復(fù)性差、工作量大、成本高[6-9]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指發(fā)生在染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。在漫長的進(jìn)化過程中，生物體形成了自身特有的DNA堿基序列，比較同一物種不同地方品種間的SNP差異，可實(shí)現(xiàn)同一物種不同地方品種間或相近物種的準(zhǔn)確鑒別。本研究通過比對五種常用條形碼序列，找出區(qū)分蒙古黃芪與膜莢黃芪的SNP位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)特異性引物，實(shí)現(xiàn)蒙古黃芪與膜莢黃芪的科學(xué)、準(zhǔn)確鑒別，為規(guī)范黃芪藥材市場提供技術(shù)支撐。本研究已申請相關(guān)專利。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究從山西、內(nèi)蒙古、吉林等黃芪的主產(chǎn)區(qū)采集蒙古黃芪與膜莢黃芪野生與栽培植物樣本共計(jì)89份，經(jīng)王文全教授鑒定為正品，標(biāo)本存放于中國中藥有限公司，樣本的產(chǎn)地及GPS信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 將采集的各黃芪植物葉片樣本使用硅膠進(jìn)行干燥，待完全干燥后，使用小鋼珠與球磨儀(FRITSCH PULVERISETTE 6，德國)將樣本進(jìn)行粉碎研磨。利用試劑盒法(CTAB法，天根生化，DP305試劑盒)提取植物樣本基因組總DNA。具體步驟見說明書。總DNA提取時(shí)對說明書中步驟3進(jìn)行改良，將氯仿改為氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，有效去除樣本中的淀粉或酚類雜質(zhì)。同時(shí)將步驟4中的緩沖液GP2改為異丙醇(-20 ℃保存使用)，降低試劑成本。提取完成的DNA樣本放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選、PCR擴(kuò)增與電泳檢測 選擇常用的DNA條形碼序列，對蒙古黃芪與膜莢黃芪樣本的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10-11]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，組成為ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR MIX 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL。各引物序列及PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[10]。

對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。配置1%瓊脂糖凝膠(0.6 g瓊脂糖+60 mL 0.5×TBE緩沖液，微波加速溶解；加入1 μL核酸染料GeneGreen，待冷卻至65 ℃左右時(shí)倒入放置梳子的膠盒內(nèi)；室溫放置10～20 min，凝膠徹底凝固后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內(nèi)，電泳槽內(nèi)的TBE緩沖液需沒過凝膠)，將PCR產(chǎn)物點(diǎn)入凝膠內(nèi)，同時(shí)點(diǎn)入DNA Marker(DL2000)，調(diào)整電泳儀電壓至140 V，時(shí)間為30 min，開始電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像儀，紫外燈下觀察電泳條帶，如每份樣品均有單一且明亮的條帶，說明PCR擴(kuò)增成功，可進(jìn)行后續(xù)測序工作。

表1 黃芪樣本信息表

1.2.3 測序與序列分析 將全部PCR產(chǎn)物點(diǎn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，并對凝膠中的條帶位置進(jìn)行切膠回收，并對回收后的產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測序。測序完成后，對返回的序列運(yùn)用Codon Code Aligner軟件進(jìn)行序列拼接，去掉低質(zhì)量區(qū)序列；運(yùn)用MEGA軟件進(jìn)行序列比對與分析，找到可以穩(wěn)定準(zhǔn)確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的引物序列以及SNP位點(diǎn)。

1.2.4 特異性引物設(shè)計(jì) 根據(jù)可穩(wěn)定鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的SNP變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)鑒別蒙古黃芪的特異性引物。通過Primer Premier 6.0軟件，在ITS序列的上游選擇約20 bp長度的互補(bǔ)序列作為上游引物序列，在ITS序列下游SNP變異位點(diǎn)前后分別設(shè)計(jì)三組引物作為下游引物。這三段序列的反向互補(bǔ)序列分別對應(yīng)特異性引物的下游三組引物序列。并運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件對引物序列進(jìn)行分析，確定退火溫度并進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.5 特異性引物鑒別 蒙古黃芪與膜莢黃芪樣本，按照1.2.1與1.2.2所述方法進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增與電泳檢測。其中，PCR擴(kuò)增所用引物對為1.2.4所設(shè)計(jì)的特異性引物對。通過觀察瓊脂糖凝膠電泳圖檢驗(yàn)特異性引物鑒別結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對與特異性引物開發(fā)

經(jīng)過MEGA軟件序列比對分析，發(fā)現(xiàn)在ITS序列中的476位點(diǎn)呈現(xiàn)規(guī)律性的突變堿基(Single Nucleotide Polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性，SNP變異位點(diǎn))。該位點(diǎn)位于ITS序列的ITS2區(qū)段上游，在ITS2序列第91位點(diǎn)處(測得的ITS2序列經(jīng)在線網(wǎng)站http：∥its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/注釋，全長224 bp)。蒙古黃芪在ITS序列的476位點(diǎn)為C堿基，膜莢黃芪在ITS序列的476位點(diǎn)為T堿基(如圖1所示)。蒙古黃芪與膜莢黃芪psbA-trnH、rbcL及matK序列比對分析均未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的變異位點(diǎn)。

根據(jù)蒙古黃芪與膜莢黃芪ITS序列SNP位點(diǎn)，運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性鑒別蒙古黃芪的特異性引物對。三對引物分別為：

引物對1序列上游：5′-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3′和下游：5′-GCCGCGAGGCAACAACGCTCAC-3′；

引物對2序列上游：5′-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3′和下游：5′-AATTTTCAACCAGCCGCGAGGCA-3′；

圖1 蒙古黃芪與膜莢黃芪ITS序列SNP變異位點(diǎn)

引物對3序列上游：5′-ACTTAGACAAACTTATGAATC-3′和下游：5′-AGGACTCAATTTTCAACCAG-3′。

運(yùn)用Primer Premier 6.0軟件確定退火溫度并進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，最終確定各引物對的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

引物對1的PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min(每個(gè)循環(huán)增加3 s)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；

引物對2的PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min(每個(gè)循環(huán)增加3 s)，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；

引物對3的PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min(每個(gè)循環(huán)增加3 s)，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

2.2 特異性引物鑒別蒙古黃芪

基于設(shè)計(jì)的特異性引物對，通過對樣本進(jìn)行DNA提取、運(yùn)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測，可根據(jù)電泳檢測的結(jié)果判斷所檢測樣本為蒙古黃芪或膜莢黃芪。如電泳檢測在特定的位置(400 bp左右)擴(kuò)增出清晰的條帶，可判定檢測樣本為蒙古黃芪，如在特定的位置未檢測到特征條帶，則所檢測的樣本不是蒙古黃芪。運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異性引物對蒙古黃芪與膜莢黃芪樣本進(jìn)行鑒別PCR產(chǎn)物電泳圖見圖2。

注：A.特異性引物對1；B.特異性引物對2；C.特異性引物對3；樣品編號參考表1樣品表，MG為蒙古黃芪，MJ為膜莢黃芪；MARKER為DM2000 DNA Marker。圖2 特異性引物對鑒別蒙古黃芪電泳檢測圖

根據(jù)電泳圖可看出，三對特異性引物均能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出蒙古黃芪樣品，而膜莢黃芪樣本不能擴(kuò)增出條帶，擴(kuò)增條帶大小約400 bp。電泳圖結(jié)果顯示特異性引物可準(zhǔn)確鑒別蒙古黃芪樣本。

3 討論

黃芪為補(bǔ)氣良藥，以補(bǔ)虛為主，性甘，微溫，具有補(bǔ)氣升陽，固表止汗等功效，多用于氣虛乏力，表虛自汗，氣虛水腫等癥。近幾年隨著黃芪需求量的不斷增加，野生黃芪的數(shù)量急劇減少，現(xiàn)黃芪已被列為國家三級保護(hù)植物[12]。黃芪資源的產(chǎn)地變遷歷史較為復(fù)雜，特別是蒙古黃芪，因此目前市場上黃芪藥材的種源比較混亂，經(jīng)常出現(xiàn)各地間串種的現(xiàn)象[13]。在黃芪產(chǎn)業(yè)前端的種子種苗市場，經(jīng)常出現(xiàn)蒙古黃芪與膜莢黃芪種子混雜的現(xiàn)象，而從外觀形態(tài)很難進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別，從而嚴(yán)重影響黃芪藥材的種植熱情及質(zhì)量控制。

DNA條形碼技術(shù)在中藥基原鑒定方面已有廣泛的研究與應(yīng)用基礎(chǔ)[14]。中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則列入《中華人民共和國藥典》四部通則，通過對大樣本量中藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動(dòng)物類藥材DNA條形碼鑒定體系[15]。DNA條形碼應(yīng)用于藥用植物種內(nèi)不同產(chǎn)地樣本或近緣物種的鑒別研究也有先例[16-17]。本研究以DNA條形碼技術(shù)為理論基礎(chǔ)，通過比較蒙古黃芪與膜莢黃芪的五種常用DNA條形碼序列，運(yùn)用生物信息學(xué)的技術(shù)，篩選可快速、準(zhǔn)確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的條形碼序列，分析挖掘穩(wěn)定的SNP變異位點(diǎn)，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪。本研究結(jié)果表明ITS/ITS2序列可準(zhǔn)確鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪，在ITS序列第476位點(diǎn)(位于ITS2序列上游)，蒙古黃芪為堿基C，而膜莢黃芪為堿基T。依據(jù)ITS序列的SNP變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)三對特異性引物，電泳膠圖結(jié)果表明特異性引物可實(shí)現(xiàn)對蒙古黃芪準(zhǔn)確快速的鑒別。

中藥材市場，特別是中藥材種子種苗以及飲片市場，受限于種子種苗或飲片自身的特征或標(biāo)準(zhǔn)不健全，相對于中藥材原藥材來說在鑒別方面存在更多的困難。區(qū)別于農(nóng)作物，特別是經(jīng)濟(jì)作物，中藥還存在產(chǎn)地藥材質(zhì)量及臨床療效差異的道地性現(xiàn)象。當(dāng)前中藥產(chǎn)業(yè)中普遍存在的問題是種源混亂、同一藥材不同基原或不同產(chǎn)地品種間鑒別困難，對于中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提出巨大的挑戰(zhàn)。因此，研究快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的中藥基原鑒別技術(shù)有利于中藥產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督監(jiān)管以及可持續(xù)發(fā)展。DNA條形碼技術(shù)經(jīng)過十余年的發(fā)展已逐漸成熟，由理論與實(shí)驗(yàn)研究向可應(yīng)用于市場、企業(yè)、監(jiān)督管理部門的實(shí)用性技術(shù)轉(zhuǎn)變，該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、科學(xué)等特點(diǎn)，對于傳統(tǒng)的藥材鑒別方法是一個(gè)較好的補(bǔ)充。中藥企業(yè)應(yīng)建立相關(guān)品種的較為完善的中藥材DNA條形碼分子鑒定數(shù)據(jù)庫，以便于更為科學(xué)準(zhǔn)確地滿足中藥材鑒定的市場需求。同時(shí)，DNA條形碼技術(shù)也有其應(yīng)用的局限性，特別是針對儲存較久或貯藏不當(dāng)造成生蟲、發(fā)霉等現(xiàn)象的中藥樣本以及經(jīng)過高溫加工炮制后的中藥飲片或中成藥等，會(huì)因?yàn)镈NA污染或降解等原因給DNA條形碼鑒定工作帶來挑戰(zhàn)。隨著生物技術(shù)，特別是基因組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，從基因組學(xué)的層面去發(fā)現(xiàn)中藥道地性的遺傳機(jī)制將成為今后研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。