趙海忠，李良華，宋忠旭，孫 華，彭先文，梅書棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的豬的一種接觸性傳染病，以高熱、出血和高死亡率為特征，傳播途徑廣泛[1]。在我國現(xiàn)階段豬瘟持續(xù)散發(fā)，以隱性、溫和型感染為主，流行態(tài)勢復(fù)雜，是阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一[2-3]。種豬場開展豬瘟凈化，從源頭上控制疾病的傳播，對保障種豬場的健康、穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義[4]。2018年湖北某規(guī)?；N豬場進(jìn)行了豬瘟病原、免疫抗體水平檢測，擬通過淘汰豬瘟野毒感染豬、抗體陰性豬群補打豬瘟活疫苗等管理措施，實現(xiàn)豬瘟凈化。

1 材料與方法

1.1 材料

采集公母豬群扁桃體樣36份；采集公豬血樣22份、母豬血樣36份、后備豬血樣24份、仔豬血樣20份，冷鏈保存后送實驗室檢測。

1.1.1 主要儀器 Eppendorf移液器，Eppendorf離心機，DYY-8C型電泳儀，SUNRISE-BASIC型酶標(biāo)儀，EDC-810型PCR擴(kuò)增儀，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.2 主要試劑 豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒為北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)；豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒為IDEXX公司生產(chǎn)。根據(jù)GenBank收錄的CSFV的E2基因設(shè)計特異性引物，由大連寶生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段大小為272 bp。

1.2 檢測方法

1.2.1 RT-PCR檢測 取適量送檢樣品，置于碾缽中充分碾磨至糊狀，加入滅菌生理鹽水2～3 mL混勻后，取1.0 mL混合液至1.5 mL滅菌離心管中，置于超低溫冰箱中反復(fù)凍融3次。嚴(yán)格按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書要求抽提病毒RNA，并按反應(yīng)體系要求進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，待反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.2 基因測序分析 對CSFV E2基因陽性條帶明顯的 10#、14#、18#、27#、33# 樣品 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序。從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜集其他CSFV參考毒株的E2基因，對比本試驗測序毒株與其他參考毒株同源性，分析所測得序列與其他毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2.3 抗體檢測 采用豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒對102份血清樣品進(jìn)行檢測，嚴(yán)格參照試劑盒使用說明進(jìn)行檢測和判定。樣品豬瘟抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：阻斷率≥40%為陽性，阻斷率≤30%為陰性，30%＜阻斷率＜40%為可疑。并對檢測數(shù)據(jù)計算和分析抗體的離散度、平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟病原RT-PCR檢測結(jié)果

豬瘟病原套式RT-PCR方法擴(kuò)增CSFV E2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。檢測結(jié)果顯示，36份樣品中有 10#、14#、18#、27#、33# 等 5 份擴(kuò)增出 E2 基因272 bp的片段，CSFV核酸陽性比例為13.9%?？赡艽嬖谝岸靖腥荆氝M(jìn)一步基因測序甄別。

圖1 CSFV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 CSFV核酸基因測序分析結(jié)果

取5份核酸陽性樣品CSFV E2基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序，分別得到序列134 HBWH-1/2018.9.28、135 HBWH-2/2018.9.28、136 HBWH-3/2018.9.28、137 HBWH-4/2018.9.28、138 HBWH-5/2018.9.28，與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫不同參考株E2片段進(jìn)行比對，豬瘟E2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：10號、27號和33號母豬CSFV核酸陽性屬豬瘟野毒感染，均為豬瘟病毒2.1c亞型，與當(dāng)前豬瘟疫苗毒株在不同分支；14號和18號母豬CSFV核酸陽性與疫苗毒株在同一分支，為豬瘟疫苗毒。

圖2 CSFV E2基因遺傳進(jìn)化樹分析

2.3 豬瘟抗體檢測結(jié)果

豬瘟抗體檢測結(jié)果見表1，種公豬和后備豬豬瘟抗體陽性率為100%，種母豬豬瘟抗體陽性率為91.70%，表明種豬群豬瘟免疫效果理想。仔豬豬瘟抗體陽性率為80%，抗體平均值為54，表明仔豬豬瘟抗體陽性率較好，但抗體離散度達(dá)到46%，仔豬抗體參差不齊，有被野毒感染的風(fēng)險，需篩查原因，有必要進(jìn)一步監(jiān)測仔豬母源抗體水平變化，優(yōu)化免疫程序，進(jìn)一步提高其抗體整齊度。

表1 豬瘟抗體檢測結(jié)果

3 討論

（1）種豬群抗體陽性率達(dá)91.7%，高于國家豬瘟強制免疫抗體合格率70%，抗體平均值76，離散度23%，表明種豬群免疫程序合理。但仔豬豬瘟抗體陽性率雖達(dá)80%，但離散度也達(dá)46%，抗體水平參差不齊。仔豬豬瘟抗體離散度較大的原因可能源于未監(jiān)測仔豬母源抗體水平變化，盲目套用免疫程序；也可能源于豬瘟野毒感染母豬，經(jīng)胎盤垂直感染給胎兒或感染仔豬水平傳播，免疫時出現(xiàn)免疫耐受，造成免疫失敗。

（2）CSFV核酸陽性檢測率13.9%，經(jīng)監(jiān)測其中60%為野毒、40%為疫苗毒。3例豬瘟野毒毒株與郭銳等報道2.1c毒株已經(jīng)成為湖北地區(qū)流行毒株相一致[5]。但檢出3頭豬瘟野毒感染母豬臨床上未表現(xiàn)豬瘟癥狀，以隱性感染存在，持續(xù)帶毒，須及時淘汰。實踐中僅根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果淘汰陽性豬，易誤淘汰疫苗帶毒豬。2頭豬瘟疫苗毒個體主要原因是采樣與豬瘟疫苗免疫時間間隔21 d，豬瘟病原檢測應(yīng)在免疫30 d后進(jìn)行。

（3）病原和抗體檢測相結(jié)合的豬瘟凈化方式，有利于提高淘汰野毒感染豬的效率。對檢出的豬瘟抗體陰性豬強化免疫，及時補打豬瘟疫苗，30 d后再次檢測抗體，仍為陰性者，直接淘汰。這樣通過提高豬群豬瘟抗體水平，可提高豬場母豬繁殖性能和小豬生長性能[6]。