翟健 韓曉晨 閆金銀

[摘要] 目的 探討蒜素（Allicin）抑制人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞生長的作用及機(jī)制。方法 將培養(yǎng)的TPC-1細(xì)胞分為對照組和不同濃度（10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin處理組。四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法測定不同濃度的Allicin處理24、48、72 h對TPC-1細(xì)胞生長的抑制作用。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察Allicin處理前后細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測Allicin對細(xì)胞周期的影響。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測Allicin作用細(xì)胞后凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的變化。 結(jié)果 與對照組比較，不同濃度的Allicin均可抑制TPC-1細(xì)胞的生長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Allicin對細(xì)胞的抑制率與時間和濃度兩大要素相關(guān)。隨著Allicin濃度的增加，G2/M期細(xì)胞所占比例明顯升高，G0/G1期細(xì)胞所占比例降低，除對照組與10 μg/mL Allicin組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），其他相鄰濃度組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與對照組比較，各濃度Allicin處理組細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)量均降低，Bax表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;各相鄰濃度Allicin處理組Bcl-2及Bax表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Allicin具有抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞生長的作用，其機(jī)制可能與Allicin抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 蒜素;甲狀腺乳頭狀癌;細(xì)胞周期;Bcl-2;Bax

[中圖分類號] R736.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Allicin inhibition on the growth of human thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells. Methods The cultured TPC-1 cells were divided into the control group and the Allicin treatment groups with different concentrations （10， 20， 30， 40， 50 μg/mL）. Methylthiazoletrazolium （MTT） method was used to determine the inhibitory effect of different concentrations of Allicin treatment on the growth of TPC-1 cells at 24， 48， 72 h. Inverted microscope and scanning electron microscope were used to observe the change of cell morphology and ultrastructure after treatment by Allicin. Flow cytometry was used to test the effects of Allicin on cell cycle. Immunocytochemical technique was used to detect the effects on expression of intracellular apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 after treatment by Allicin. Results Compared with the control group， different concentrations of Allicin could inhibit the growth of TPC-1 cells， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the inhibition rate of Allicin on cells was related to time and concentration. With the increase of Allicin concentration， the proportion of G2/M phase cells was significantly increased， while that of G0/G1 phase cells was decreased. All pairwise comparison of adjacent concentration groups showed statistically significant differences （P < 0.05） except the control group and 10 μg/mL Allicin group （P > 0.05）. Compared with the control group， the intracellular Bcl-2 expression was decreased and Bax expression was increased in every concentration of Allicin treatment group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression levels of Bcl-2 and Bax in Allicin treatment groups with different adjacent concentrations were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Allicin can inhibit the growth of TPC-1 cells of papillary thyroid cancer， and its mechanism may be related to inhibition of cell proliferation by Allicin and the induction of apoptosis by down-regulating Bcl-2 and up-regulating Bax.

[Key words] Allicin; Papillary thyroid carcinoma; Cell cycle; Bcl-2; Bax

甲狀腺癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率逐年上升，尤其是在我國沿海地區(qū)發(fā)病率增長速度更快，女性因受到雌激素的影響，發(fā)病率也明顯高于男性[1-2]。甲狀腺癌類型包括未分化癌、乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌。其中乳頭狀癌最為常見，惡性度較低，預(yù)后較好。當(dāng)前醫(yī)學(xué)界對于甲狀腺癌的主要治療方式為手術(shù)切除，患者術(shù)后需要服用相關(guān)藥物來完成輔助治療，但臨床治療結(jié)果表明部分甲狀腺乳頭狀癌在病情發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)失分化，生長速率加快，進(jìn)而出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等特征，從而影響患者的愈后。因此，尋找新的安全、有效的輔助療法，對提升甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療效果，同時保證患者的生存質(zhì)量，減少患者痛苦具有重要意義。蒜素（Allicin）是蔥科蔥屬植物大蒜的鱗莖（大蒜頭）中提取的具有生物活性的有機(jī)硫化合物的總稱，Allicin是一種天然抗菌、抗感染成分，可有效提高人體免疫力，防治心血管疾病及腫瘤[3-5]。本研究通過體外實驗探尋Allicin抗甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的作用及可能機(jī)制，為其在臨床的開發(fā)應(yīng)用及最終轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1（百恩維生物科技有限公司）;Allicin（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）;兔抗人Bax/Bcl-2單克隆抗體、二抗（抗兔）以及DAB顯色試劑（生工生物工程股份有限公司）;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;FC酶標(biāo)儀（美國熱電公司）;BX53顯微鏡（日本奧林巴斯公司）;FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)? 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率? 收集對數(shù)生長期TPC-1細(xì)胞以4×104個/mL的密度接種到96孔板，200 μL/孔，待細(xì)胞貼壁后換液，每孔分別加入200 μL含不同濃度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培養(yǎng)基，以含0 μg/mL Allicin的培養(yǎng)基作為對照組，以其他濃度作為實驗組，同時設(shè)置空白組（不加細(xì)胞），針對實驗組和對照組每個濃度設(shè)置5個平行孔。37℃、5%CO2飽和濕度的培育箱中分別孵育24、48、72 h后向每孔中添加濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，在添加完成之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后用吸量管吸去各孔培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩溶解10 min，在酶標(biāo)儀上檢測吸光度值（A）（波長570 nm）并根據(jù)結(jié)果計算每組細(xì)胞生長抑制率，其計算公式為：（1-實驗組A/對照組A）×100%，每組試驗均重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察? 細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)至貼壁后換液，分別加入含不同濃度Allicin的培養(yǎng)基，對照組（0 μg/mL），實驗組（30 μg/mL），孵箱中培養(yǎng)48 h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，收集細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛固定后OTO法處理，酒精脫水，在臨界點(diǎn)處進(jìn)行真空噴鍍，隨后用電鏡對細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期? TPC-1細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)期時換液，分別給予含不同濃度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培養(yǎng)基，以含0 μg/mL Allicin的培養(yǎng)基作為對照組，以其他濃度作為實驗組，培養(yǎng)48 h后1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞（離心半徑13.5 cm），冷PBS洗滌，洗滌完成后進(jìn)行離心處理，75%乙醇-20℃固定24 h后2000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm）去固定液，冷PBS重懸洗滌細(xì)胞1000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm）收集細(xì)胞，分別加入RNase和PI染料重懸，細(xì)胞懸液用300目濾網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀對處理完成的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)情況? 細(xì)胞爬片后分別給予含不同濃度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培養(yǎng)基，以含0 μg/mL Allicin的培養(yǎng)基作為對照組，以其他濃度作為實驗組，孵箱中培養(yǎng)48 h后應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用IPP軟件分析Bcl-2和Bax的IOD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Allicin對TPC-1細(xì)胞生長的影響

MTT結(jié)果顯示，不同濃度Allicin均可抑制人體甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖，同一時間點(diǎn)相鄰濃度組比較以及組內(nèi)相鄰時間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Allicin對細(xì)胞的抑制率與時間和濃度兩大要素相關(guān)。見表1。

2.2 Allicin對細(xì)胞形態(tài)的影響

對照組細(xì)胞緊密排列，貼壁生長，外形為不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞膜光滑且輪廓清晰，細(xì)胞大小均一，具有良好的透光性，細(xì)胞活性良好，未見大量死亡細(xì)胞，生長狀態(tài)良好。實驗組細(xì)胞皺縮、體積變小、輪廓模糊，細(xì)胞間隙大且細(xì)胞透光度有所下降，通過顯微鏡觀察可見大量無活性細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)較差。見圖1。

2.3 Allicin對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

對照組細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，細(xì)胞膜上可見大量微絨毛緊密排列，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)完好，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)部無空泡。細(xì)胞核漿均較大，核仁形態(tài)正常，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)均勻分布，且時而可見多個核仁，細(xì)胞形態(tài)正常。實驗組細(xì)胞體積變小，胞漿有所降低，細(xì)胞表面微絨毛減少，在細(xì)胞內(nèi)可見空泡，細(xì)胞核膜呈現(xiàn)內(nèi)陷狀，核質(zhì)比降低，細(xì)胞染色質(zhì)分布不規(guī)則，呈固縮樣改變，部分細(xì)胞可見胞核的碎裂和溶解，可見細(xì)胞凋亡樣改變。見圖2。

2.4 Allicin對TPC-1細(xì)胞周期變化的影響

實驗組細(xì)胞基因表達(dá)出現(xiàn)紊亂，G2/M期細(xì)胞占比隨Allicin濃度提升而明顯升高，G0/G1期細(xì)胞占比隨Allicin濃度升高而逐漸降低，除對照組（0 μg/mL Allicin）與10 μg/mL Allicin組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），其他相鄰濃度組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3、表2。

2.5 Allicin對Bcl-2和Bax在細(xì)胞中表達(dá)的影響

對照組與各實驗組中均有Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)，對圖片進(jìn)行分析后可以發(fā)現(xiàn)，隨著Allicin濃度增加，Bcl-2表達(dá)量降低，而Bax表達(dá)量增加。與對照組比較，各濃度Allicin處理組細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)量均降低，Bax表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;各相鄰濃度Allicin處理組Bcl-2及Bax表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、圖4（封四）。

3 討論

Allicin是蔥科蔥屬植物大蒜的鱗莖（大蒜頭）中提取的具有生物活性的有機(jī)硫化合物的總稱，作為一種天然源特性的藥物，Allicin具有抵抗細(xì)菌感染，防治心血管相關(guān)疾患，防治多種腫瘤，提高機(jī)體免疫功能等功效[3-5]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)該活性物在乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、卵巢癌等多種常見惡性腫瘤臨床治療中有明顯效果[6-8]。本研究通過體外實驗探尋Allicin抗甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的作用及可能機(jī)制，為其在臨床的開發(fā)應(yīng)用及最終轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品提供進(jìn)一步理論依據(jù)。

顯微鏡下觀察顯示，人體甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞具有多形性，胞膜光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，具有良好透光性，細(xì)胞膜表面微絨毛較多，各細(xì)胞器清晰可見，且時而可見多個核仁。Allicin處理組可見細(xì)胞體積變小，胞漿有所降低，細(xì)胞表面微絨毛較處理前減少，在細(xì)胞內(nèi)可見空泡，細(xì)胞核膜呈現(xiàn)內(nèi)陷狀，核質(zhì)比降低，細(xì)胞染色質(zhì)分布不規(guī)則，呈固縮樣改變，部分細(xì)胞可見胞核的碎裂和溶解，可見細(xì)胞凋亡樣改變。以上結(jié)果與Zhang等[9]研究Allicin抗胃癌效果和譚祺媛[10]在Allicin抗結(jié)腸癌中觀察到的結(jié)果一致。由此可見，Allicin除了能誘導(dǎo)胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時也可有效促進(jìn)TPC-1細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

實驗組細(xì)胞基因表達(dá)出現(xiàn)紊亂，G2/M期細(xì)胞占比隨Allicin濃度提升而明顯升高，G0/G1期細(xì)胞占比隨Allicin濃度升高而逐漸降低，除對照組與10 μg/mL Allicin組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.443），其他相鄰濃度組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;與對照組比較，各濃度Allicin處理組細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)量均降低，Bax表達(dá)量均升高，各相鄰濃度Allicin處理組Bcl-2及Bax表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），呈劑量依賴性。但目前，造成G2/M期阻滯的具體機(jī)制并不完全清楚，Xiao等[11]研究結(jié)論指出，造成肺癌細(xì)胞G2/M期的阻滯與Allicin抑制了細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）的表達(dá)有關(guān)。Kelkel等[12]研究發(fā)現(xiàn)Allicin作用后B細(xì)胞淋巴瘤微管蛋白解聚紡錘體微管形成過程受阻，有效阻止了細(xì)胞增殖過程。此研究結(jié)果從理論上證實了Allicin可以抑制TPC-1增殖，進(jìn)而達(dá)到一定抗癌效果，為未來的甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療以及其他惡性腫瘤治療提供了理論依據(jù)。

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，對照組與實驗組中Bcl-2和Bax蛋白均有表達(dá)，但隨著Allicin濃度升高，Bcl-2表達(dá)量降低，Bax表達(dá)量增加。許多研究已證實Bcl-2蛋白表達(dá)具有控制細(xì)胞凋亡的作用[13-14]，Bcl-2蛋白有兩類：一類為控制凋亡作用蛋白，如Bcl-XL、Bcl-W等;另一類具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bid等[15]。研究表明，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量小于Bax，則兩者共同作用形成同源二聚體，從而降低線粒體膜電位，提高線粒體的通透能力，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放[16-18]，進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究結(jié)果提示Allicin可通過線粒體途徑促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Allicin作用于TPC-1細(xì)胞可抑制其增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療甲狀腺癌的目的，提示Allicin可能成為甲狀腺癌手術(shù)和放化療治療之外的一種新的輔助性治療手段，值得進(jìn)一步的實驗和臨床研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Paes JE，Hua K，Nagy R，et al. The relationship between body mass index and thyroid cancer pathology features and outcomes：a clinicopathological cohort study [J]. Clin Endocrinol Metab，2010，95（9）：4244-4250.

[2]? Chu R，van Hasselt A，Vlantis AC，et al. The cross-talk between estrogen receptor and peroxisome proliferator-activated receptor gamma in thyroid cancer [J]. Cancer，2014，120（1）：142-153.

[3]? Casella S，Leonardi M，Melai B，et al. The role of diallyl sulfides and dipropyl sulfides in the in vitro antimicrobial activity of the essential oil of garlic，Allium sativum L，and leek，Allium porrum L [J]. Phytother Res，2013，27（3）：380-383.

[4]? Lai KC，Hsu SC，Kuo CL，et al. Diallyl sulfide，diallyl disulfide，and diallyl trisulfide inhibit migration and invasion in human colon cancer colo 205 cells through the inhibition of matrix metalloproteinase-2，-7，and -9 expressions [J]. Environ Toxicol，2013，28（9）：479-488.

[5]? Borkowska A，Sielicka-Dudzin A，Herman-Antosiewicz A，et al. Diallyl trisulfide-induced prostate cancer cell death is associated with Akt/PK dephosphorylation mediated by P-p66shc [J]. Nutr，2012，51（7）：817-825.

[6]? Antony ML，Singh SV. Molecular mechanisms and targets of cancer chemoprevention by garlic-derived bioactive compound diallyl trisulfide [J]. Exp Biol，2011，49（11）：805-816.

[7]? Li Y，Zhang J，Zhang L，et al. Diallyl trisulfide inhibits proliferation，invasionand angiogenesis of osteosarcoma cells by switching on suppressor microRNAs and inactivating of Notch-1 signaling [J]. Carcinogenesis，2013，34（7）：1601-1610.

[8]? Murai M，Inoue T，Suzuki-karasaki M，et al. Diallyl trisulfide sensitizes human melanoma cells to TRAIL-induced cell death by promoting endoplasmic reticulum-mediated apoptosis [J]. Oncol，2012，41（6）：2029-2037.

[9]? Zhang W，Ha M，Gong Y，et al. Allicin induces apoptosis ingastric cancer cells through activation of both extrinsic and intrinsic pathways [J]. Oncol Rep，2010，24（6）：1585-1592.

[10]? 譚祺媛.大蒜素通過上調(diào)bax基因下調(diào)bcl-2基因誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LS-174-T細(xì)胞凋亡[D].齊齊哈爾：齊齊哈爾大學(xué)，2012.

[11]? Xiao D，Zeng Y，Hahm ER，et al. Diallyl trisulfide selectively causes Bax- and Bak- mediated apoptosis in human lung cancer cells [J]. Environ Mol Mutagen，2009，50（3）：201-212.

[12]? Kelkel M，Cerella C，Mack F，et al. ROS-independent JNK activation and multisite phosphorylation of Bcl-2 link diallyl tetrasul fide-induced mitotic arrest to apoptosis [J]. Carcinogenesis，2012，33（11）：2162-2171.

[13]? Koing A，Wrazel L，Warrell RP Jr，et al. Comparaitve acivity of melarsoprol and arsenic trioxide in chlroinc B-cell leukemia lines [J]. Blood，1997，90（2）：562-570.

[14]? 王立生，吳祖澤，賀福初.程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因及調(diào)節(jié)作用[J].生理科學(xué)進(jìn)展，1996，27（2）：153-156

[15]? Zeng H，Kong X，Peng H，et al. Apoptosis and Bcl-2 family proteins，taken to chronic obstructive pulmonary disease [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（6）：711-727.

[16]? 宋文靜，陳小艷，趙秀蘭，等.線粒體蛋白Bcl-2和Bax在腫瘤發(fā)生中作用的初步探討[J].中國腫瘤臨床，2009， 36（24）：1409-1411.

[17]? Park HY，Kim GY，Moon SK，et al. Fucoidan inhibits the proliferation of human urinary bladder cancer t24 cells by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis [J]. Molecules，2014，19（5）：5981-5998.

[18]? 胡鍇，劉好朋，萬婷，等.線粒體與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：86-88.

[19]? 于翠娟，孟艷玲，王成濟(jì)，等.凋亡誘導(dǎo)因子是線粒體內(nèi)介導(dǎo)核凋亡的最主要蛋白質(zhì)之一[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2002，29（2）：177-179

[20]? Reed JC. Double identity for Proteins of Bcl-2 family [J]. Nauter，1997，387（6635）：773-776.

（收稿日期：2018-09-04? 本文編輯：羅喬荔）