(1.浙江省環(huán)境監(jiān)測中心, 杭州 310012；2.上海城市水資源開發(fā)利用國家工程中心有限公司,上海 200082；3.浙江樹人大學(xué) 杭州, 310015)

硒是人體必需的微量營養(yǎng)元素，近20年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)硒具有清除自由基、抗癌、保護(hù)肝臟、防衰老、增強免疫等生物學(xué)功能[1-4]。但是不同形態(tài)的硒化合物的營養(yǎng)學(xué)性質(zhì)和毒理學(xué)性質(zhì)相差很大。自然界中硒的存在形態(tài)分為無機硒和有機硒。一般情況下無機硒過量會導(dǎo)致有機生物體的中毒反應(yīng)，而有機硒具有相對較高的生物利用度。有機硒和無機硒在環(huán)境遷移過程中還可以相互轉(zhuǎn)化。因此，為獲得硒在環(huán)境和人體內(nèi)的存在形式及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律、評價其生物毒性，不僅需要測定其總量，還必須進(jìn)行形態(tài)分析。

環(huán)境樣品中無機硒主要有單質(zhì)硒、硒化物、亞硒酸鹽和硒酸；有機硒主要有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸等。由于硒的不同化學(xué)形態(tài)中既含有硒元素，又具有有機物的性質(zhì)，因此，將有機物分離技術(shù)如高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)與某些特征元素檢測技術(shù)，如原子熒光(AFS)、質(zhì)譜(MS)等相結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)是目前形態(tài)硒檢測方法的發(fā)展趨勢[5]。高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用作為一種高靈敏的分析測試技術(shù)在金屬及類金屬形態(tài)分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。這主要是因為HPLC具有高效的分離能力，而ICP-MS具有較低的檢測限、寬泛的動態(tài)線性范圍、良好的分析精密度等優(yōu)點。目前HPLC-ICP-MS測定形態(tài)硒的報道中最常采用的液相柱為Hamilton PRP陰離子交換柱[6-11]，其次為Waters Symmetry Shield RP18[12-13]和C18[14,15]等。

使用C8柱進(jìn)行形態(tài)硒測定的報道極為少見，僅辛?xí)詵|等人[16]采用C8柱，以0.15mmol/LEDTA(鉀)-0.1mmol/L四丁基氫氧化銨-0.15mmol/L乙酸銨-5%甲醇為流動相， 分離出了水樣中2種無機硒化物(Se(IV)和Se(VI))；呂亞寧等人[17]采用C8柱，以0.1mmol/L四丁基氫氧化銨-0.1mmol/L乙酸銨-10%甲醇為流動相， 分離出了果汁樣中Se(IV)和Se(VI)。本研究以C8柱作為分離柱，采用0.1%七氟丁酸-20mmol/L磷酸二氫鉀-5%甲醇混合溶液為流動相，建立了水樣中5種硒形態(tài)(硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸)的HPLC-ICP-MS分析方法，該法高效、簡便、線性范圍寬、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于環(huán)境水體中硒形態(tài)的分析測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

儀器：iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科學(xué)(中國)有限公司)；ICS-1500型液相色譜(美國戴安公司)；Mili-Q純水機(美國Millipore公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：硒酸根(GBW10033,41.5±1.3μg/g以硒計)、亞硒酸根(GBW10032,42.9±0.9μg/g以硒計)、甲基-硒代半胱氨酸(GBW10088,34.8±1.0μg/g以硒計)、硒代胱氨酸(GBW10087,44.2±1.0μg/g以硒計)，均購于中國計量科學(xué)研究院；硒代蛋氨酸(純度98%)，購于北京百靈威科技有限公司。

試劑：甲醇(色譜純)，購于美國Fisher公司；磷酸二氫鉀(分析純)，購于臨平化工試劑廠；七氟丁酸(純度99%)，購于賽默飛世爾科學(xué)(中國)有限公司；實驗用水由Mili-Q純水機制備(電導(dǎo)率>18.2MΩ?cm)；色譜進(jìn)樣前所有樣品均經(jīng)0.22μmPES聚醚砜濾膜(德國Membrance公司)過濾。

1.2 檢測條件

HPLC條件：色譜柱：Hypersil Gold C8(250mm×4.6 mm×5 μm)；等度分離流動相：20mmol/L磷酸二氫鉀-0.1%七氟丁酸-5%甲醇；流速：1.2mL/min。

ICP-MS條件： ICP發(fā)射功率為1550W；霧化氣流量為0.90L/min；冷卻氣流量為14.0 L/min；輔助氣流量為0.8L/min；碰撞氣流量為4.5mL/min；駐留時間為0.1ms，檢測同位素為78Se。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液與工作液的配制

準(zhǔn)確移取適量硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸和甲基-硒代半胱氨酸，配制成1.00mg/L單標(biāo)中間液。用萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱取0.0127g硒代蛋氨酸固體標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量超純水，用超聲波中完全溶解，轉(zhuǎn)移定容至100mL容量瓶中，配制得到50mg/L儲備液；使用時，將其稀釋至1.00mg/L。取所有單標(biāo)，用超純水逐級稀釋成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品處理及分析測定

水樣用0.22μmPES聚醚砜濾膜(德國Membrance公司)過濾后即可直接進(jìn)樣，進(jìn)樣體積：25μL。

2 結(jié)果及討論

2.1 ICP-MS測定同位素的選擇

硒有6種同位素，分別是74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se，其中80Se的豐度最大(49.96%)，其次是78Se(23.61%)和82Se(8.84%)。但是78Se、80Se和82Se均存在不同程度的質(zhì)譜干擾，如80Se會受到40Ar40Ar的嚴(yán)重干擾，78Se受到40Ar38Ar,38Ar40Ca的干擾、82Se受到40Ar42Ca的干擾。本研究采用碰撞池技術(shù)，以氦氣為碰撞氣來消除質(zhì)譜干擾。楊修斌等人[6]同時對78Se、80Se和82Se3種同位素進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因大豆中形態(tài)硒分析，結(jié)果表明在碰撞池模式下3種同位素被檢測時所得色譜峰形保持一致，即在碰撞池模式下多原子離子干擾質(zhì)譜干擾可被消除至可以忽略不計。環(huán)境水體的基體比較簡單，為了盡可能避免質(zhì)譜干擾，本研究未采用質(zhì)譜干擾最嚴(yán)重的80Se，而用78Se作為最終的檢測同位素。

2.2 流動相pH的影響

在硒的形態(tài)分析中常用到三氟乙酸、五氟丙酸和七氟丁酸等全氟羧酸[12]，或者添加烷基磺酸鈉、氫氧化四甲基銨等反相離子對試劑[16]作為流動相成分。反相離子對色譜中，影響化合物保留時間的因素有配對離子、流動相性質(zhì)、相比，柱溫和離子強度等。本研究以Hypersil Gold C8(250mm x 4.6 mm x 5 μm)為分離柱，流動相為0.1%七氟丁酸，含3%甲醇，流速1.0mL/min，實驗了在流動相中(1)不加離子強度劑；(2)分別加入10mmol/L、20mmol/L和30mmol/L氯化銨調(diào)節(jié)離子強度；(3)分別加入10mmol/L、20mmol/L、25 mmol/L和30mmol/L磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)離子強度這3組情況下硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在柱上的分離情況。結(jié)果表明：(1)不加離子強度劑時5種硒化物僅出來2個峰。測定該流動相，其pH值約為2.5；(2)加入不同濃度的氯化銨時硒酸根和亞硒酸根不能分開，但3種有機硒有較好的分離效果。測定該流動相的pH值，發(fā)現(xiàn)加入氯化銨后流動相呈中性。(3)加入10mmol/L磷酸二氫鉀時硒酸根和亞硒酸根得到了有效分離，但3種有機硒不能完全分開。提高磷酸二氫鉀的濃度至20mmol/L以上時，5種硒化物分離效果令人滿意。測定該流動相的pH值約為3左右。

各種硒形態(tài)在不同pH條件下以陽離子、陰離子或兩性離子的形式存在[18]，因此流動相的酸度直接影響了各硒化合物的離子存在形態(tài)。在酸性條件下，有機硒可被質(zhì)子化形成陽離子，可與七氟丁酸陰離子形成較穩(wěn)定離子對，在柱上有一定的保留能力。同時，有機硒化合物由于具有一定的疏水性，本身也能在柱上吸附。兩種無機硒化物硒酸根(pK21.7)和亞硒酸(pK12.46，pK27.31)在水溶液中主要以酸根陰離子形式存在，較難與七氟丁酸形成穩(wěn)定的離子對，因而在柱子上保留時間很短，幾乎在死時間即均被洗脫，很難得到有效分離。本研究加入適量濃度的磷酸二氫鉀時流動相的pH值<4，一部分亞硒酸可能未發(fā)生離解[6]，使得硒酸根和亞硒酸根的物理性質(zhì)不同而在色譜柱上得到了有效分離。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著磷酸二氫鉀濃度的提高，硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸在柱上的保留時間均略有提前，但提前幅度不大；硒代蛋氨酸保留時間有明顯提前?？紤]到流動相中高濃度磷酸二氫鉀基體會在進(jìn)入ICP-MS進(jìn)行定量檢測時易沉積在錐孔上產(chǎn)生嚴(yán)重的基體效應(yīng)，本研究最終選擇加入20mmol/L磷酸二氫鉀作為離子強度調(diào)節(jié)劑。增加流動相中甲醇含量可以降低流動相的極性，使離子對在管柱內(nèi)的保留時間縮短，但過量的甲醇會使電流不穩(wěn)定，且易導(dǎo)致ICP點火失敗，本文參照辛?xí)詵|等人[16]的研究結(jié)果，選擇流動相中加入甲醇的濃度為5%。同時，為了進(jìn)一步提高分離效率，設(shè)置流動相流速為1.2mL/min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

采用本實驗建立的方法進(jìn)行檢測，在10min內(nèi)5種硒形態(tài)均得到了很好的分離，色譜圖見圖1。按照《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》HJ168—2010的規(guī)定，對空白樣品加入0.5μg/L硒混標(biāo)標(biāo)樣連續(xù)測定7次，以3.14倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限。各形態(tài)硒的線性范圍、線性方程和檢出限見表1。GB/T14848—2017《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和GB3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中Ⅰ類水體中硒的限值為0.01mg/L，本研究建立方法的檢出限比該值低2個數(shù)量級，滿足環(huán)境水體的檢測要求。

圖1 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(50μg/L)

硒形態(tài)線性范圍(μg/L)線性回歸方程相關(guān)系數(shù)方法檢出限(μg/L)硒酸根1～100A=1196.8C+320.61.0000.13亞硒酸根1～100A=1406.2C+573.91.0000.09硒代胱氨酸1～100A=1385.5C+679.81.0000.10甲基-硒代半胱氨酸1～100A=1228.2C+632.91.0000.07硒代蛋氨酸1～100A=1209.8C+4151.0000.23

2.4 實際樣品的測定

對某地表水、地下水和自來水管末梢水3個環(huán)境水樣進(jìn)行了形態(tài)硒檢測，除該地下水樣品中硒酸根和亞硒酸根有檢出外，其余樣品均未檢出硒化物。地下水色譜圖見圖2，檢測濃度結(jié)果見表2。

圖2 某地下水及其加標(biāo)樣的形態(tài)硒色譜圖(a).地下水；(b).地下水加標(biāo)0.5μg/L

μg/L

目前市面上無在售的形態(tài)硒混合標(biāo)準(zhǔn)水樣。為驗證方法的準(zhǔn)確性和精密度，分別進(jìn)行了加標(biāo)回收和平行測定實驗。在表2地表水樣品中添加低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加濃度平行測定6次，加標(biāo)回收率范圍為76.1%～93.1%，樣品平行測定RSD%范圍為1.6%～13.6%，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，本研究建立的反相離子對色譜聯(lián)合電感耦合等離子體質(zhì)譜法，可在10min內(nèi)有效分離測定環(huán)境水體中的5種形態(tài)硒，方法簡便、快速、靈敏度高、精密度好，在環(huán)境水體元素形態(tài)分析中具有良好的應(yīng)用前景。

表3 地表水樣品的平均加標(biāo)回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)